碳氮源對不同特性紅曲菌株L、Idu產色素及桔霉素的影響

陳慎，黃穎穎，陸東和，楊成龍*

(1.福建省農業科學院農業工程技術研究所，福州 350003；2.福建省農產品(食品)加工重點實驗室，福州 350003)

紅曲是以大米作為培養基通過紅曲菌發酵制成的一種紫紅色米曲。福建、江蘇、浙江、臺灣等地區均為常見產地，其中以福建省為主。目前，紅曲廣泛應用于釀酒、食品著色及中藥領域[1]。紅曲發酵過程中產生的天然色素紅曲紅在食品著色領域應用最為廣泛，但同時紅曲紅生產過程中桔霉素的生成也制約著紅曲色素產業的進一步發展[2]。法國Blanc博士在1995年證實紅曲霉在代謝過程中具有產生真菌毒素桔霉素(Citrinin)的能力[3]，研究表明桔霉素具有導致腎臟衰竭、損害肝臟代謝及致畸致癌的作用[4-6]。

紅曲的液態發酵生產過程在國內已具有相當成熟的工藝，并廣泛應用于實際生產[7，8]。當前對紅曲產桔霉素的研究主要集中于生產工藝方面[9-13]，對發酵過程中營養源起到的因素研究相對較少。因此研究紅曲桔霉素的代謝過程中營養源對發酵的影響，分析最優的營養源選擇，調整液態發酵過程的關鍵條件以達到降低桔霉素的目的是當前一個重要的研究方向。

本研究選取本實驗室篩選出的高產桔霉素的菌株L和低產桔霉素的菌株Idu，通過添加不同碳氮源分析這兩個菌株產色素及桔霉素的規律，可為紅曲固態培養中外加營養源的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

采用本實驗室保藏的紅曲霉菌株L和Idu進行活化培養和進一步試驗。

1.1.2 培養基

1.1.2.1 斜面培養基

將麥芽磨粉后加入10倍的蒸餾水熬煮至10 °Bé的麥芽汁，加入2.5%瓊脂，pH調至6～7后混合加熱溶解，121 ℃滅菌30 min。

1.1.2.2 液體種子培養基

采用250 mL三角瓶，50 mL蒸餾水中加入6.0%葡萄糖，2.0%胰蛋白胨，0.2% NaNO3，0.2% KH2PO4，0.1% MgSO4，pH自然。并加入數顆小玻璃珠，121 ℃滅菌30 min后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅曲霉培養方法

1.2.1.1 斜面種子的制備

選取保藏的純種紅曲霉種子，接種于斜面培養基，于35 ℃的恒溫培養箱中培養13天，備用。

1.2.1.2 液體種子的制備

培養好的斜面菌種加入無菌水并用接種環刮下孢子之后，轉接至液體培養基，接種量2 mL，于32 ℃，150 r/min恒溫搖床內培養3天，重復接種液體培養基1次，培養2天后，取出備用。

1.2.2 碳源對紅曲菌L、Idu桔霉素含量的影響

在液態培養基中加入不同碳源作為培養基質，考察不同碳源(大米粉、蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、木糖、木糖醇、甘露醇)對紅曲菌L、Idu 產桔霉素的影響。

1.2.3 氮源對紅曲菌L、Idu桔霉素含量的影響

在液態培養基中加入不同氮源作為培養基質，考察不同氮源(硫酸銨、硝酸銨、谷氨酸鈉、酵母膏、蛋白胨)對紅曲菌L、Idu產桔霉素的影響。

1.2.4 色價及桔霉素含量的測定

1.2.4.1 色價的測定及計算方法

胞內色價的測定：將抽濾的菌絲體于60 ℃烘干至恒重后磨碎，稱取約0.05 g的烘干菌絲體至50 mL比色管中，用70%乙醇溶液稀釋定容至25 mL，在提取溫度60 ℃、提取頻率100 kHz、提取功率300 W的提取條件下超聲波輔助提取15 min，搖勻靜置后稀釋適當倍數(b倍)，以70%乙醇溶液做空白對照，測定胞內色素的OD值。

胞外色價的測定：取1 mL分離菌絲體后的發酵液，用70%乙醇溶液稀釋適當倍數(a倍)，以70%乙醇溶液做空白對照，測定胞外色素的OD值。

總色價(E)=胞外色價+胞內色價；胞內色價=(25×b×OD×G1)/G2；胞外色價=a×OD×V。

注：V為發酵液總體積；G1為烘干菌絲體總質量；G2為烘干菌絲體樣品質量。

1.2.4.2 桔霉素的測定及計算方法

參考國家標準(GB 5009.222-2016)測定并計算桔霉素的含量[14]。

稱取經充分粉碎的均質試樣1.0 g(精確至0.1 g)于50 mL 具塞錐形瓶中，加入20 mL 甲醇-水(70+30)提取液，以高速均質器高速均質提取2 min，過濾提取液，移取1.0 mL濾液，置于另一干凈的容器中，加入39 mL PBS緩沖溶液稀釋、混勻；以玻璃纖濾紙過濾待免疫親和柱凈化。

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下，準確移取10.0 mL上述澄清濾液過免疫親和柱，以1～2滴/s的流速全部通過親和柱；加入10 mL 0.1%吐溫20-PBS溶液，以1～2滴/s的流速淋洗柱子，直至空氣進入到親和柱中，棄去全部流出液。準確加入1.0 mL甲醇-0.1%磷酸溶液(70+30)進行洗脫，洗脫流速為1～2滴/s。收集全部洗脫液于玻璃試管中，供檢測用。

將試樣溶液注入高效液相色譜儀，測定相應的峰面積，得到試樣溶液中桔青霉素的濃度。

試樣中桔青霉素含量按下式計算：

式中：X為試樣中桔青霉素的含量(μg/kg)；ρ為樣液中桔青霉素的濃度(μg/L)；V為定容體積(mL)；f為樣液稀釋倍數；m為樣液所代表的試樣量(g)。計算結果需扣除空白值。計算結果保留兩位有效數字。

2 結果與分析

2.1 桔霉素標準曲線的繪制

配制0，1.0，5.0，10.0，50.0 ng/mL 5個濃度的桔霉素標準工作液。在儀器最佳工作條件下，用桔霉素標準工作溶液分別進樣，以相應的桔青霉素的色譜峰的峰面積為縱坐標,以標準工作溶液中桔青霉素的濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

圖1 桔霉素標準曲線Fig.1 Citrinin standard curve

由圖1可知，在1～50 ng/mL的范圍內，峰面積與桔霉素質量濃度之間線性關系較好，回歸方程為y=1291.5x+517.22，R2=0.9991。

2.2 碳氮源對所選菌株產物的影響特性研究

2.2.1 各種碳源對菌株L、Idu產色素及桔霉素的影響研究

在紅曲菌L的液態發酵過程中，不同種類碳源對色素與桔霉素產量的影響見圖2。

圖2 不同碳源對菌株L色素與桔霉素產量的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the yield of L pigment and citrinin in strain

由圖2可知，葡萄糖、麥芽糖、甘露醇作為碳源時色素產量都較高，分別達到了218.40，206.52，145.08 U/mL，相對應的桔霉素產量依次為75.24，69.32，68.4 mg/mL。大米粉作為碳源的菌株發酵后色價可達到72.02 U/mL，同時桔霉素含量最低，僅為1.74 mg/L。綜合色價與桔霉素產量來看，大米粉作為常規碳源其色價與桔霉素的比值最高，在實際生產中的意義較大，適宜在產業化過程中使用。

在紅曲菌Idu的液態發酵過程中，不同種類碳源對色素與桔霉素產量的影響見圖3。

圖3 不同碳源對菌株Idu色素與桔霉素產量的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on the yield of Idu pigment and citrinin in strain

與菌株L相比，菌株Idu產色素的能力較低，同時產桔霉素的能力也顯著降低。不同培養基中，麥芽糖作為碳源的發酵液色價最高，為56.94 U/mL，其余依次為葡萄糖、蔗糖、木糖、大米粉與甘露醇。桔霉素產量最大的碳源為蔗糖，其產量可達2.91 mg/L，最低的碳源為大米粉，桔霉素含量為0.6 mg/L。在選用的所有7種碳源中，6種碳源發酵產物的桔霉素含量均低于1 mg/L。由此可知，不同碳源對菌株Idu的色素產量具有顯著影響，但對桔霉素的產量影響不大。

2.2.2 各種氮源對菌株產色素及桔霉素的影響研究

在紅曲菌L的液態發酵過程中，不同種類氮源對色素與桔霉素產量的影響見圖4。

圖4 不同氮源對菌株L色素與桔霉素產量的影響Fig.4 Effects of different nitrogen sources on the yield of L pigment and citrinin in strain

由圖4可知，不同氮源對菌株L的產色能力和產桔霉素能力均具有一定的促進作用，其中谷氨酸鈉對該菌株的兩種代謝產物促進能力最強，色素含量可達63.96 U/mL，桔霉素含量可達8.13 mg/L。硝酸銨、酵母膏、硫酸銨對菌株L產色能力和產桔霉素能力的促進作用均不及谷氨酸鈉，發酵液色價均為24 U/mL左右，桔霉素含量為1 mg/L左右。綜合不同氮源的色素與桔霉素產出之比，谷氨酸鈉在作為氮源時，菌株L的發酵液色價最高，同時桔霉素含量在較為可控的范圍內，因此選擇谷氨酸鈉作為該菌株的最優氮源。

在紅曲菌Idu的液態發酵過程中，不同種類氮源對色素與桔霉素產量的影響見圖5。

圖5 不同氮源對菌株Idu色素及桔霉素產量的影響Fig.5 Effects of different nitrogen sources on the yield of Idu pigment and citrinin in strain

由圖5可知，該液態發酵過程與菌株L相似，谷氨酸鈉對菌株Idu產2種代謝產物促進能力最強，色素含量最高可達48.86 U/mL，但桔霉素的含量達到19.59 mg/L，而酵母膏、硝酸銨、硫酸銨對該菌株的產色素促進能力依次降低，對應的桔霉素含量也依次降低。與菌株L相同，谷氨酸鈉作為氮源時，色素產量和桔霉素產量均有提高，但谷氨酸鈉對Idu菌株的產桔霉素能力促進作用明顯高于菌株L，因此采用Idu作為生產菌株時需慎重選擇氮源。

3 結論

在高產桔霉素紅曲菌株L的發酵過程中，碳源對該菌株的產色素能力和產桔霉素能力都有顯著影響，選取的4種碳源均具有顯著的促進作用，但僅僅以大米粉作為碳源時，桔霉素產量最少。因此大米粉作為常規碳源其色價與桔霉素的比值最高，在實際生產中的意義較大；而在氮源的選取上，選取4種氮源對菌株L的產色能力和產桔霉素能力也同樣具有促進作用，其中谷氨酸鈉對該菌株的2種代謝產物促進能力最強，綜合不同氮源的色素與桔霉素產出之比，選取谷氨酸作為該菌種的氮源較為合適。

在低產桔霉素菌株Idu的發酵過程中，麥芽糖作為碳源的發酵液色價最高，其余依次為葡萄糖、蔗糖、木糖、大米粉與甘露醇。蔗糖作為碳源時桔霉素的產量最高，大米粉最低。在選取的所有7種碳源中，6種碳源發酵產物的桔霉素含量均低于1 mg/L，因此整體而言，碳源對Idu菌株的桔霉素產量影響不大，選取促色素產量最高的麥芽糖較為合理；在氮源的選取上，由于桔霉素的產量隨著菌種產色能力的增加而增加，因此選取產桔霉素最少的硫酸銨作為氮源以避免發酵產品桔霉素的超標。

紅曲霉次級代謝產物紅曲色素與桔霉素同屬于聚酮化合物，2種產物合成受聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)的催化。在聚酮體合成的過程中，一分子乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)單位與3個或者多個丙二單酰輔酶A(malonyl coenzyme A，malonyl-CoA)通過脫羧縮合、甲基化形成四酮體(tetraketide)，隨后2天不同的代謝途徑分別轉化為桔霉素和色素。

當前研究并沒有很好地闡述該2種途徑的影響因素，碳氮源對不同菌種生成次級代謝產物的影響過程可能是由于不同的營養因子對合成酶系活性的變化產生了作用，因此還需進一步的研究分析來確定紅曲霉代謝的關鍵影響因素。

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