HPLC同時測定三七不同部位4種皂苷含量

唐卿雁 陳庚 盧迎春 張廣輝 趙艷 張憲民 楊生超

摘 要 建立同時測定三七地上和地下部分人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc含量的高效液相色譜方法。采用Agilent Zorbax EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色譜柱，流動相為乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫40℃。結果表明：人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc分別在0.062～18.479、0.060～17.870、0.063～18.556、0.064～19.169 μg，呈良好線性關系（r>0.999 95）；三七中4種皂苷的平均回收率（n=6）分別為99.53%、100.56%、99.90%、99.60%，RSD分別為0.54%、0.60%、0.49%、0.55%。在三七地上部分和地下部分各組織中，人參皂苷Rb1在蘆頭部位的含量最高，人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc和三七皂苷Fc的含量均在葉片中最高。該方法簡便、準確，分離效果好，適用于三七人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的測定。

關鍵詞 三七 ；高效液相色譜法 ；皂苷含量

中圖分類號 R917 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.09.018

Abstract The high performance liquid chromatography （HPLC） method was established for simultaneous determination of ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc and notoginsenoside Fc in different parts of Panax notoginseng. The Agilent Zorbax EC-C18 （4.6 mm×100 mm， 2.7 μm） column was used in the HPLC， the mobile phases were acetonitrile-0.2% phosphoric acid with gradient elution， the detection wavelength was 203 nm， the flow rate was 1.0mL/min， and the column temperature was 40℃. The results showed that ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc and notoginsenoside Fc had good linearity relationship （r>0.999 95） in the range of 0.061 6～18.479， 0.060～17.870， 0.063～18.556 and 0.064～19.169 μg， respectively. The ginsenosides Rb1， Rb3 and Rc， and notoginsenoside Fc had average recoveries （n=6） of 99. 53%， 100.56%， 99.90 % and 99.60%， and their relative standard deviations were 0.54%， 0.60%， 0.49% and 0.55%， respectively. The results showed that the saponins content in the underground parts and aerial parts were different apparently. The content of ginsenoside Rb1 was the highest in the rhizome， while the contents of ginsenosides Rb3 and Rc， and notoginsenoside Fc were the highest in the leaves. This HPLC method was simple and accurate with better separation effect， and hence was suitable for determination of ginsenosides Rb1， Rb3， Rc and notoginsenoside Fc.

Keywords Panax notoginseng ； high performance liquid chromatography ； saponins content

三七[Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen]是五加科人參屬多年生草本植物，又名山漆、金不換、血參、田山七等[1]。有近600年的使用歷史和400年的栽培歷史[2]，其最適栽培區主要分布在我國云南、廣西等地[3]。三七具有散瘀止血、消腫定痛、防止腦缺血、降脂和保護肝臟等功效[4-5]，與人參共享“北參南七”的美稱。人們的傳統習慣多以三七的根及根莖入藥， 現已開發以三七為主要原料的藥品、保健品、化妝品達數百種，如云南白藥、復方丹參滴丸、血塞通、片仔癀等[6]。人參皂苷是三七的主要活性物質，目前已從三七的不同部位分離得到70余種單體皂苷[7-8]。人參皂苷按照其苷元結構可劃分為3類，即達瑪烷型、齊墩果烷型和奧克梯隆型。達瑪烷型人參皂苷按照苷元上連接的羥基不同又可分為原人參二醇型和原人參三醇型[9]。三七所含的人參皂苷主要為原人參二醇及原人參三醇型皂苷[10]。目前的研究主要集中在三七地下部分的單體皂苷物質，而一些稀有皂苷，尤其是對三七地上部分皂苷的研究相對較少。三七地上部分和地下部分單體皂苷的種類和含量差別較大，因此有必要探討一種方法能同時對其進行檢測。本試驗利用高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography， HPLC）對三七地上和地下部分均含有的4種單體皂苷含量進行測定和分析，為進一步合理利用三七，尤其是對三七地上部分進行綜合開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

試驗材料采集于云南省文山州硯山縣，經云南農業大學楊生超教授鑒定為三七。選取15株長勢良好、完整的3年生三七植株，按不同部位分開，分為須根、主根、蘆頭、果、莖、果梗、葉片。將三七各部位樣品放入105℃烘箱中烘20 min后，將溫度降至85～86℃烘至恒重，取出，置干燥器中冷卻至室溫，用粉碎機粉碎后過65目篩備用。參照中國藥典2015年版一部[11]中三七含量測定方法，略做改動。取各樣品粉末0.6 g，精密稱定，加入50 mL甲醇，稱量，超聲（100 W，50 kHz）處理30 min，冷卻，再稱量，用甲醇補足損失的量，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。

1.1.2 儀器和試劑

Agilent 1260系列高效液相色譜儀（G1311C四元泵，G1329B 自動進樣儀，G1316A 柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器）和Agilent ChemStation 工作站，梅特勒托利多AE240 型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），微型高速萬能粉碎機（北京中興偉業儀器有限公司），NB-5200 型超聲波儀（鄭州南北儀器設備有限公司）。

人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201122，純度95%）由中國藥品生物制品檢定所提供，人參皂苷Rc對照品（批號：MUST-17030322，純度99.65%）和人參皂苷Rb3對照品（批號：MUST-17030212，純度99.65%）由中科院成都生物研究所提供，三七皂苷 Fc對照品（批號：15061204，純度99.80%）由成都普瑞科技開發有限公司提供。乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax EC-C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，24% A，10～40 min，24～36% A，40～50min，36%～100% A），流速1 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫40℃，進樣量為10 μL。

1.2.2 線性關系考察

分別精確稱取人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc標準品6.35、6.38、6.52、6.35 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，搖勻，制得單一標準品溶液。分別精密量取標準品溶液1、2、5、10、15、20 μL，注入高效液相色譜儀，以色譜峰峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（X，μg） 為橫坐標繪制標準曲線，結果見表1。

人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc標準品的高效液相色譜圖如圖1。

1.2.3 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10 μL，按1.2.1項下色譜條件連續進樣6次，求得人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的峰面積的相對標準偏差RSD分別為0.2%、0.1%、0.3%、0.2%，表明儀器精密度良好。

1.2.4 重復性試驗

分別精密稱取三七主根部位粉末0.5 g，平行稱定6份，按1.1項下方法操作，制備供試品溶液6份，按1.2.1項下色譜條件，測定人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc，以人參皂苷 Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc標準樣品為對照峰，相對峰面積的RSD分別為0.5%、0.5%、0.2%、0.4%，表明該方法有較好的重復性。

1.2.5 穩定性試驗

三七主根部位待測供試品溶液按1.2.1項下色譜條件，分別在0、2、4、6、12、24 h分別進樣測定。結果顯示，人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的RSD分別為0.6%、0.4%、0.3%、0.5%，表明供試品溶液在48 h內穩定。

1.2.6 回收率試驗

精密量取已知含量的三七主根部位粉末約0.25 g，加入1.2.2制備的標準樣液各5 mL，按1.1 方法制備供試溶液，按1.2.1色譜條件測定峰面積并計算回收率。結果人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc平均回收率（n=6）分別為99.53%、100.56%、99.90%、99.60%，RSD分別為0. 54%、0.60%、0.49%、0.55%。

1.2.7 樣品含量測定

取1.1的供試品溶液，依1.2.1項條件進樣測定，利用外標法計算人參皂苷Rb1、Rb3、Rc和三七皂苷Fc的含量，并通過SPSS 19.0 軟件對數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 三七地下部分各組織的皂苷含量分析

對三七地下不同部位4種皂苷含量進行測定分析，結果見表2。

三七地下部分的人參皂苷Rb1含量最高，其中蘆頭部位的Rb1含量顯著高于主根和須根。主根中未檢測到人參皂苷Rb3和三七皂苷Fc，而蘆頭與須根中人參皂苷Rb3含量較低，且差異不顯著。蘆頭與須根之間比較，三七皂苷Fc含量蘆頭高于須根，兩者差異顯著。人參皂苷Rc在蘆頭部位的含量高于主根，而須根略高于主根。對4種皂苷的總量進行比較可知，在三七的地下部分中，蘆頭的皂苷總量最高，其次是主根和須根。

2.2 三七地上部分各組織的皂苷含量分析

三七地上部分各組織的皂苷含量測定結果如表3。由表3可以看出，葉片、莖、果、果梗各部位的皂苷含量差異較大。

對地上部分不同部位的人參皂苷Rb1含量分析可知，它在葉片中含量較高，其次為果梗、莖和果，但各部位Rb1含量差異不顯著。莖的人參皂苷Rb3含量較低，其他3個部位人參皂苷Rb3含量大小順序依次為葉片、果梗和果，葉片與果梗之間的人參皂苷Rb3含量差異顯著，而莖與果之間的人參皂苷Rb3含量差異不顯著。葉片中人參皂苷Rc含量最高，果梗次之，果和莖的較低。葉片與果梗之間的人參皂苷Rc含量差異顯著，果與莖之間的人參皂苷Rc含量差異不顯著。三七地上各個部位三七皂苷Fc含量比較可知，葉片的最高，其次是果梗、果和莖。葉片與果梗之間的三七皂苷Fc含量差異顯著，果與莖之間的差異不顯著。對三七地上部分四種皂苷的總量進行比較可知，葉片的皂苷總量遠高于其他幾個部位，其次是果梗和果，莖中的皂苷總量最低。

3 討論與結論

3.1 討論

對三七地上和地下部分的4種皂苷含量進行比較分析可知，地上部分的總皂苷含量比地下部分的高，而地下部分蘆頭中人參皂苷Rb1的含量最高。三七的地下部分已經被廣泛地用于藥物的研發，地上部分則利用率較低。三七地上部分除富含豐富的皂苷外，還含有黃酮類、氨基酸類、揮發油、微量元素等有用成分[12]，具有較高的開發潛力。

三七的皂苷含量與其生長的年限、種植環境等有較大關系，因此不同年限和不同產地的三七各部位皂苷種類及含量還有待深入比較分析。由于本試驗只測定了4種在三七地上和地下部分都存在的主要皂苷，而三七具有極高的藥用價值，源于其含有多種具有生理活性的皂苷。因此，還有很多類型的皂苷有必要去進一步測定。同時，三七皂苷積累的分子機理，可通過利用轉錄組、代謝組和蛋白組等生物技術手段進行深入研究[13-15]。

3.2 結論

本研究測定了3年生三七不同部位的4種皂苷，即人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc和三七皂苷Fc的含量，結果表明三七地下部分人參皂苷Rb1的含量最高，其中蘆頭是人參皂苷Rb1主要積累的部位。地上部分的葉片中人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc和三七皂苷Fc含量顯著高于其他部位，說明人參皂苷Rb3、Rc主要在葉片部位積累。

本試驗建立了同時檢測三七地上和地下部分人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rc和三七皂苷Fc的方法。該方法條件簡單，分離效果好，重現性高，可為三七的質量評價以及合理開發利用提供依據。

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