牛雙芽巴貝斯蟲病PCR檢測試劑盒研制

吳位珩萬廷友劉鏡孫啟躍廖梅楊莉余波徐景峨*

（1，貴州省畜牧獸醫(yī)研究所 550005；2，貴州省大方縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 551600；3，貴州省畜禽品種改良站 550005）

牛雙芽巴貝斯焦蟲（Batesiosis Bigeminum）病是對(duì)牛危害較大的一種血液寄生蟲病。據(jù)有關(guān)資料表明，牛雙芽巴貝斯焦蟲病在世界各地普遍存在，在我國，主要分布長江以南，有浙江、江蘇、西藏、云南、貴州、江西、福建、廣東、廣西等省區(qū)。貴州省由于氣候多溫暖潮濕，適宜傳播媒介蜱的生長發(fā)育，因此，牛雙芽巴貝斯焦蟲病分布于全省各地州市縣，凡是引進(jìn)純種牛、雜交牛和本地牛混合飼養(yǎng)放牧的場所，極容易發(fā)生和流行此病，其感染率高達(dá)70～80%左右，給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的損失。在該病診斷上，傳統(tǒng)血涂片早期診斷，由于蟲體含量低，難以在光學(xué)顯微鏡下分辨到，由于而且該病易與其他牛血液原蟲（如附紅體病、牛巴貝斯）混合感染，后期易繼發(fā)出敗感染，給確診該病帶來困難，對(duì)此，根據(jù)PCR原理建立起診斷牛雙芽巴貝斯焦蟲的PCR檢測方法，自主研制出牛雙芽巴貝斯蟲PCR檢測試劑盒，該試劑盒具有敏感、特異、快速簡便的特點(diǎn)，此方法不失為牛雙芽巴貝斯蟲病臨床診斷的好方法。

1 材料與方法

1.1 材料來源

采集貴州省某品種改良站感染發(fā)病的胚胎移植受體牛35頭的全血各1ml，并加入酸性檸檬酸葡萄糖溶液B（既ACD）進(jìn)行抗凝，1ml全血加入抗凝劑ACD的量為0.175ml，置于-20℃中備用。

1.2 參考菌株

牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株DNA模板，由中國科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲病室惠贈(zèng)。附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA模板，均由本所畜禽疫病研究室采集病料提取的模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)牛雙芽巴貝斯焦蟲熱休克蛋白基因片段設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出一長度為318bp大小的特異片段，該序列在Genbank上的登錄號(hào)為AF332567.1。引物序列如下：

上引物：5’-CCC CTA TCA CCT TCA ACC-3’

下引物：5’-ACT GCG AGC ACT CAA TCC-3’

由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 PCR試劑盒的組成

①紅細(xì)胞裂解液；②TBS液；③蛋白酶K；④裂解液；⑤PCR酶；⑥D(zhuǎn)L2000 Marker；⑦引物；⑧陽性對(duì)照；⑨陰性

對(duì)

照；⑩TE緩沖液；?吸附柱。

1.4.1 紅細(xì)胞裂解液組成

1.5M NH4Cl，100nM KHCO3，10nM EDTA-Na，用 1N HC1或1N NaOH調(diào)pH至7.2～7.4。

1.4.2 TBS液

10mmol/L的Tris含0.9%NaCl，用1N HCl調(diào)pH至7.4。

1.4.3 蛋白酶K

用TE溶液配制成20mg/ml。

1.4.4 裂解液

10mM的 Tris-HCL、1mM的EDTA、2.5M的NaCl以及占裂解液總體積5%的SDS組成的混合溶液。

1.4.5 TE緩沖液

10mM的Tris-HCL及1mM的EDTA組成的混合溶液，混合溶液的pH值為7.8。

1.4.6 PCR酶

10mM的Tris-HCL（PH8.3）、 50mM的KCl、 1.5mM的MgCl2 及 0.05U Polymerase/μl。

1.4.7 引物

上引物為 5’-CCC CTA TCA CCT TCA ACC-3’

下引物為5’-ACT GCG AGC ACT CAA TCC-3’

1.4.8 對(duì)照液

陰性對(duì)照為超純水；陽性對(duì)照為牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA模板。

1.4.9 清洗劑

體積百分比為70%的乙醇。

1.4.10 收集

采用吸附柱收集DNA模板。

1.5 全血中牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA的提取

取1000μl全血于1.5ml的離心管中，10000r/min，離心2min，去上清；用1000μl生理鹽清洗，10000r/min，離心2min，去上清，采用同樣的方法共清洗3次，收集沉淀。在收集沉淀的離心管中，加入200μl的生理鹽水和200～400μl的紅細(xì)胞裂解液，充分搖勻，10000r/min，離心2min，去上清。在離心管中加入200μlTBS液、40μl蛋白酶K，搖勻，再加入160μl裂解液充分混勻，70℃水浴作用15-20分鐘，取出，加入無水乙醇200μl，充分搖勻，然后倒入吸附柱里，離心2min，去上清，加入500μl清洗劑進(jìn)行清洗，10000r/min，離心1min，反復(fù)清洗兩次，然后將倒掉了清洗劑吸附柱10000r/min，再離心2min，取出吸附柱，置室溫5min，將清洗劑完全晾干。再將吸附柱放入另一個(gè)干凈的收集管中，加入 60～100μlTE 緩沖液，室溫放置 2～5min，10000r/min，離心2min。為了獲得更多的DNA模板，可將離心過的溶液再加在吸附柱里，同樣室溫放置2～5min，10000r/min，離心2min。然后將提取得到的DNA模板用加樣槍轉(zhuǎn)入存放DNA模板的離心管里。附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA模板的提取，與上述方法相同。

1.6 特異性片段的PCR擴(kuò)增

采用提取的DNA摸板，利用合成的引物在PCR酶的作用下進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系和條件如下：PCR酶為10μl，雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)蟲株DNA模板2μl，樣本DNA摸板2μl，上下引物各1μl，加入ddH2O至25μl，在Tgradient96擴(kuò)增儀下進(jìn)行如下循環(huán)： 94℃變性3min，94℃35s，53.4℃35s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物取7μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PCR法擴(kuò)增的特異性測定

分別用附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA為摸板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.8 PCR法擴(kuò)增的敏感性的測定

采用TU-1800spc紫外可見光光度計(jì)，取OD值為260nm，將牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA摸板稀釋100倍，進(jìn)行濃度的測量。 根據(jù)摸板濃度（μg/μl）=A260×稀釋倍數(shù)×38/1000的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的PCR方法，重復(fù)檢測3次，檢驗(yàn)牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA樣品結(jié)果的可靠性。

1.10試劑盒的保存期檢測

將試劑盒在4℃、一20℃分別保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年，對(duì)陽性樣品進(jìn)行檢測，以確定試劑盒的保存時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 牛雙芽巴貝斯焦蟲特異性片段的PCR擴(kuò)增

電泳檢測顯示約在318bp處，出現(xiàn)一條PCR目標(biāo)帶，其結(jié)果如圖1所示，與預(yù)計(jì)結(jié)果非常接近。

2.2 PCR法擴(kuò)增的特異性測定

分別用附紅體、環(huán)形泰勒焦蟲、巴貝斯焦蟲DNA為摸板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除牛雙芽巴貝斯焦蟲出現(xiàn)擴(kuò)增帶，其他的蟲株未見特異性318bp片段擴(kuò)增，結(jié)果如圖2。

圖1牛雙芽巴貝斯蟲特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 PCR特異性檢測

圖3 PCR敏感性檢測

注：M為DNA Marker DL2000，1.412ng量DNA，2.41.2ng量DNA，3.4.12ng量DNA，4.412pg 量 DNA，5.41.2pg 量DNA，6.4.12pg量DNA，7.412fg量DNA，8.41.2fg量 DNA。

圖4血樣PCR檢測結(jié)果

2.3 PCR法擴(kuò)增的敏感性的測定

測得牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的平均OD260值為0.05433nm，根據(jù)模板濃度的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果得實(shí)驗(yàn)提取的牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的含量為0.206μg/μl。在進(jìn)行敏感性試驗(yàn)時(shí)，按對(duì)數(shù)稀釋法對(duì)DNA模板進(jìn)行稀釋后，取2μl模板進(jìn)行擴(kuò)增，則牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn) DNA濃度依次為 412ng，41.2ng，4.12ng，412pg，41.2pg，4.12pg，412fg，41.2fg。可檢出的牛雙芽巴貝斯焦蟲標(biāo)準(zhǔn)DNA模板的含量最小是41.2pg，即靈敏度為41.2pg，結(jié)果如圖3。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

應(yīng)用建立的PCR方法重復(fù)檢測3次，檢驗(yàn)牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA樣品結(jié)果的可靠性。研制結(jié)果是應(yīng)用建立的PCR方法重復(fù)檢測牛雙芽巴貝斯焦蟲DNA樣品3次結(jié)果均一致，結(jié)果如圖4。

2.5 試劑盒的保存期檢測

將試劑盒在4℃、-20℃分別保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年，對(duì)陽性樣品進(jìn)行檢測，以確定試劑盒的保存時(shí)間。研制結(jié)果4℃保存1年條帶較淡，-20℃保存1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年對(duì)條帶亮度無影響。

3 討論

（1）目前，集約化、規(guī)模化養(yǎng)牛業(yè)興起，異地引種增多，流通交易頻繁，加之飼養(yǎng)管理不善等原因造成牛雙芽巴貝斯病的發(fā)生和流行，給養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展帶來很大危害，對(duì)于早期確診該病，有效地控制和預(yù)防該病發(fā)生和流行顯得尤為重要。通過研究可以看到，PCR技術(shù)在牛結(jié)核病診斷上的應(yīng)用是將該病的診斷提高到分子和基因水平，在診斷雙芽巴貝斯焦蟲病上較傳統(tǒng)的檢測方法具有更高的敏感性和特異性。而且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程僅需6h，從而有益于牛雙芽巴貝斯焦蟲病的早期診斷，這為預(yù)防和控制該病的發(fā)生和流行提供技術(shù)支撐，從而最大限度的減少改病給養(yǎng)牛業(yè)造成的損失，確保人畜健康。

（2）牛感染雙芽巴貝斯焦蟲后，機(jī)體抵抗力下降，受破壞的紅細(xì)胞達(dá)到一定程度時(shí)會(huì)表現(xiàn)出臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)造成死亡。因此，應(yīng)采用牛雙芽巴貝斯焦蟲病PCR診斷方法對(duì)牛群進(jìn)行早期診斷和治療是控制該疾病發(fā)生和流行的有效措施，該檢測方法較傳統(tǒng)的抹片顯微鏡檢測方法更具有實(shí)用性。

（3）由于牛雙芽巴貝斯焦蟲病必須依賴蜱叮咬而傳播，預(yù)防上應(yīng)殺滅養(yǎng)殖場周邊環(huán)境牛體上的蜱以切斷傳播途徑，有效預(yù)防和控制該病的流行和發(fā)生。引進(jìn)牛及牛群做隔離檢疫，牛盡量不從疫區(qū)引進(jìn)，對(duì)發(fā)病牛應(yīng)作隔離飼養(yǎng)，確診為該病的牛要及時(shí)進(jìn)行治療，其首選藥為貝尼爾，配合適量的抗生素、采用葡萄糖和VC進(jìn)行補(bǔ)液，可提高療效。