姜黃素通過上調PPARγ抑制糖基化終末產物誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷

楊青山，吳樹金，施松波，毛新展, 郭士方，陳志信，臺會平

(甘肅省人民醫院1. 骨科、2. 藥劑科，甘肅 蘭州 730000；3. 中南大學湘雅二醫院骨科，湖南 長沙 410011)

骨性關節炎(osteoarthritis, OA)是一種隨年齡增長而發病率明顯增加的慢性關節疾病, 病因及機制復雜，迄今仍未闡明。糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是體內蛋白質及脂類與葡萄糖或其他還原單糖發生非酶糖化反應生成的穩定共價化合物，它在關節軟骨內大量產生與積聚是導致OA病變的重要原因之一[1]。我們前期的研究發現，AGEs 能誘導軟骨細胞過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPARγ)的表達下調，并在OA 病變中起重要作用[2]。PPARγ的重要作用之一為可以通過其輔助活化因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1 alpha，PGC-1α)，調控線粒體功能[3]，進而抑制細胞凋亡。

姜黃素(curcumin)是從姜科姜黃屬植物姜黃中提取的一種黃色酸性酚類物質，是姜黃發揮藥理作用的活性成分。姜黃素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等多種藥理作用[4-6]，同時近年研究發現其可以有效上調PPARγ，被認為是PPARγ的天然配體[7]。姜黃素基于PPARγ的作用靶點是否對AGEs誘導的軟骨細胞損傷具有保護作用尚不清楚。因此，本研究將直接使用外源性AGEs以排除其他因素的影響，在體外培養的家兔軟骨細胞上，探討AGEs誘導軟骨細胞凋亡是否與PPARγ下調/線粒體功能損傷有關，同時觀察姜黃素是否基于上調PPARγ而發揮保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 普通級健康家兔(5周齡)由蘭州大學動物實驗中心提供。本研究中動物實驗遵循的所有程序均符合國家及甘肅省人民醫院制訂的有關實驗動物的規則和制度。

1.1.2試劑 環孢霉素A (cyclosporine A，CsA)、PPARγ抗體購自Calbiochem (La Jolla, CA, USA)；姜黃素(批號C1386)、PPARγ特異性抑制劑GW9662(批號70785)、吡格列酮 (批號P4120)，均購自Sigma公司；PPARγ活性檢測試劑盒購自Santa Cruz Biotechnology公司；ATP檢測試劑盒、TUNEL、Rhodamine-123、caspase-3活性檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術公司；其余試劑均為化學分析純。

1.1.3儀器 LS-50B型熒光分光光度計(日本Shimadu公司)；IX-70型熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2細胞培養箱(美國SHEL-LAB公司)；Model 3.9 EL酶標儀(Bio-Rad公司)。

1.2AGEs的體外制備配制0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(PBS)，然后將BSA(10 g·L-1)、D-羥乙醛(0.1 mol·L-1)、青鏈霉素(100 kU·L-1)分別溶于上述PBS中，充分搖勻，pH調至7.4，室溫下放置24 h；用0.22 μm針頭濾器過濾，滅菌、封口，置37℃恒溫箱避光孵育7 d后取出，再轉移至4 ℃冰箱無菌保存備用。使用前，將制備的AGEs裝入透析袋，放入pH 7.4的無菌PBS透析液中，透析48 h，中途更換PBS液3～4次，除去未結合的D-羥乙醛，再次用0.22 μm針頭濾器過濾。取制備的樣品用熒光分光光度計鑒定，在激發波長370 nm，發射波長440 nm處釋放熒光。

1.3兔軟骨細胞體外培養將家兔麻醉后，在無菌條件下迅速取膝關節和髖關節處軟骨，用無菌PBS沖洗2～3遍后，將其剪成1～3 mm3碎塊，將所制軟骨碎塊轉移至25 mL無菌培養瓶內，加10 mL 0.2%的胰蛋白酶后，置37℃ CO2培養箱孵育,每隔15 min振蕩1次，45 min后取出，將胰蛋白酶棄去，加入10 mL 0.2% Ⅱ型膠原酶，置于37℃ CO2培養箱孵育，每隔15 min振蕩1次，90 min后收集消化液，重復用0.2% Ⅱ型膠原酶直至所取軟骨碎片全部消化，最后收集的消化液用200目紗網過濾去除雜質，1 000 r·min-1離心10 min, 將下層的細胞層用配制好的DMEM培基稀釋后，按照2×105密度接種于培養瓶內，并加入15% 的FBS。3～5 d細胞貼壁后，更換培養基，繼續培養至細胞80%融合后，開始鑒定并傳代，僅采用1～4代細胞用于實驗。

1.4細胞凋亡檢測將細胞種植蓋玻片后，置于6孔板內，細胞培養過夜；刺激細胞發生凋亡后，吸盡培養液，在樣品中加100 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min后，PBS洗滌3次；用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察，激發波長為450 nm，發射波長為550 nm。

1.5ATP生成檢測細胞處理后吸除培養液，按6孔板每孔加200 μL比例加入裂解液，裂解后4℃ 12 000×g離心10 min，收集上清，BCA測定蛋白濃度。把ATP標準溶液用ATP檢測裂解液稀釋成適當的濃度梯度備用；按照96孔板每孔100 μL的體積配制適當量的ATP檢測液，每孔加入100 μL的ATP檢測液，室溫放置5 min，消耗掉本底ATP；每孔加入50 μL的標準品，輕輕搖晃均勻，立即在酶標儀檢測。

1.6線粒體跨膜電位(△Ψm)檢測將處理后細胞PBS漂洗2次，150 μL PBS重懸細胞，20 μL Rhodamine 123避光染色，37℃避光孵育30 min，熒光分光光度計激發波長507 nm，散發波長529 nm檢測。

1.7caspase-3活性檢測吸取細胞培養液，用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養液中，600×g4℃離心5 min收集細胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次，吸盡上清后，按照每2×106個細胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃、20 000×g離心10～15 min后，放入試劑盒檢測體系中檢測。

1.8Real-timePCR采用TRIzol 法提取總RNA，取總RNA 5 μL，olig(dT)1 μL ，加DEPC水至12 μL，混勻，4 000 r·min-1離心5 s, 70℃孵育5 min后，于冰上冷卻5 min，再加入5×Buffer 4 μL，10 mmol·L-1dNTP 2 μL, 40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL, 加DEPC水處理到19 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，37℃反應5 min，冰上驟冷5 min, 加入逆轉錄酶1 μL，總反應體系20 μL混勻，4 000 r·min-1離心5 s，之后于42℃反應60 min，72℃反應10 min，冰上驟冷結束反應。逆轉錄產物可以繼續進行PCR擴增。取PCR產物5 μL，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后攝片，用Imagemaster VDS圖像分析軟件測定產物條帶的積分光密度值。PPARγ 上游引物：5′-AGGAGCAGAGCAAAGAGGTGGC-3′，下游引物：5′-TGTGAGGACTCAGGGTGGTTCA-3′。 GAPDH上游引物：5′-TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT-3′。

1.9PPARγ活性檢測采用基于ELISA 的DNA-binding 檢測試劑盒檢測PPARγ 活性。取10 μg核蛋白，加入事先包被有PPARγ特異性雙鏈DNA結合位點的96孔板上，4℃孵育過夜。結合的PPARγ經特異的PPARγ標記顯色后檢測。

1.10Westernblot提取總蛋白，并用牛血清白蛋白標準曲線調整為一致濃度后，溶解在10 g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS)中，每份樣品取8 μL進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。倒掉封閉液,用5%的脫脂奶粉按比例稀釋一抗，將膜置于一抗孵育液中，4℃搖動(20～30次/min)過夜，用TBST洗膜3次，每次5 min。用5%的脫脂奶粉按一定比例稀釋二抗，將膜置于二抗孵育液中，室溫孵育1 h(20～30次/min)，用TBST洗膜4次，每次5 min。用ODYSSEY Fc imaging system顯色，拍照。數據用樣品與β-actin的比值表示。

Cur: Curcumin; Pio: Pioglitazone; CsA: Cyclosporine A.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

2 結果

2.1AGEs對家兔軟骨細胞凋亡的影響及姜黃素的作用如Fig 1所示，AGEs (200 mg·L-1)孵育48 h后，可以明顯誘導兔軟骨細胞的凋亡；線粒體通透性轉換孔的抑制劑CsA(100 nmol·L-1)同樣可以明顯抑制AGEs誘導的細胞凋亡(P<0.05)。同時，PPARγ特異性激動劑吡格列酮(50 μmol·L-1)及50 μmol·L-1姜黃素均可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡；50 μmol·L-1姜黃素單獨處理組對軟骨細胞未見明顯代謝及功能影響[11]，而給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導軟骨細胞凋亡的保護作用。

2.2AGEs對家兔軟骨細胞線粒體功能的影響及姜黃素的作用如Fig 2所示，AGEs(200 mg·L-1)誘導軟骨細胞線粒體△Ψm及ATP合成明顯降低，姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的損傷作用。GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導的軟骨細胞線粒體△Ψm及ATP合成下降的保護作用。

Fig 2 Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrialfunction of chondrocytes (±s, n=8)

A: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial membrane potential ( △Ψm); B: Effect of curcumin on AGEs-induced mitochondrial ATP production.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+Pioglitazone

Fig 3 Effect of curcumin on AGEs-induced expression ofcytochrome C (A), Bax and Bcl-2 (B), caspase-3(C) (±s, n=8)

*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin;▲P<0.05vsAGEs+ Pioglitazone

Fig 4 Effect of curcumin on AGEs-induced activity and

A: PPARγ activity；B: PPARγ protein level; C: PPARγ mRNA assayed by real-time PCR.*P<0.05vscontrol;ΔP<0.05vsAGEs;#P<0.05vsAGEs+Curcumin.

2.3AGEs對家兔軟骨細胞細胞色素C、caspase-3、Bax、Bcl-2表達的影響如Fig 3所示，與正常對照相比，AGEs (200 mg·L-1)能夠明顯誘導細胞色素C、caspase-3、Bax/Bcl-2比值增加，而姜黃素50 μmol·L-1及吡格列酮 50 μmol·L-1均可明顯抑制AGEs的上述作用；GW9662 10 μmol·L-1預處理后，可以明顯拮抗姜黃素及吡格列酮對AGEs誘導的細胞色素C表達、caspase-3活性、Bax/Bcl-2增加的抑制作用。

2.4AGEs對家兔軟骨細胞PPARγ表達的影響及姜黃素的作用如Fig 4所示，AGEs (200 mg·L-1)可以明顯誘導軟骨細胞PPARγ活性降低，同時伴隨PPARγ的mRNA及蛋白表達降低；50 μmol·L-1的姜黃素可以明顯上調PPARγ活性、mRNA及蛋白表達，同時，GW9662 10 μmol·L-1預處理1 h后，可以明顯抑制姜黃素的作用。

3 討論

本研究結果發現，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷，并明顯上調AGEs誘導的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應的mRNA及蛋白水平的升高，給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662預處理后，可以明顯拮抗姜黃素的保護作用。該結果表明，基于上調PPARγ的作用靶點，姜黃素可明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞線粒體損傷，進而抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡。

在本研究中，為了探討線粒體損傷在AGEs致OA病變中的作用，我們直接使用外源性AGEs以排除體內其他因素的影響，發現AGEs可以使得軟骨細胞線粒體ATP生成減少，跨膜電位(△Ψm )降低，同時caspase-3活性增加，細胞色素C釋放增加，Bax/Bcl-2的比值增加。這些結果提示AGEs可以誘導線粒體功能損傷，從而導致細胞色素C釋放, Bax/Bcl-2的比值增加，激活caspase細胞凋亡途徑, 誘導軟骨細胞凋亡, 促進OA的發生發展。進一步的研究結果顯示，PPARγ特異性激動劑吡格列酮可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞線粒體功能損傷，而預先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662可以明顯拮抗吡格列酮的作用。該結果提示，PPARγ的下調可能為AGEs誘導的線粒體功能損傷的重要機制之一。關于PPARγ對線粒體功能的調節作用的機制可能主要與PPARγ上調PGC-1α有關。PGC-1α與其下游的目標基因核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)結合后可以調控線粒體轉錄，呼吸基因的調節，另外，還可以通過誘導線粒體脂肪酸和亞鐵血紅素生物合成途徑，提高線粒體的氧化功能[3, 8]。關于AGEs下調PPARγ 后，是否通過PGC-1α途徑誘導線粒體功能損傷，尚需進一步實驗證實。

為了進一步驗證基于PPARγ靶點的保護藥物是否對AGEs誘導的線粒體功能損傷具有保護作用，我們觀察了姜黃素對AGEs誘導軟骨細胞凋亡的作用。姜黃素已在多種細胞上被證實可以明顯上調PPARγ。文獻報道，在阿爾茨海默病大鼠模型中，姜黃素通過上調PPARγ明顯抑制β-淀粉樣蛋白誘導的神經炎癥[9]；Li等[10]研究表明，姜黃素通過提高PPARγ活性，抑制氧化應激，從而抑制血管緊張素II誘導的大鼠血管平滑肌細胞炎癥和增殖。關于姜黃素對PPARγ的上調作用機制尚不十分清楚，姜黃素或為PPARγ的天然配體，與PPARγ直接結合后激活PPARγ，或通過與體內某些受體結合后間接激活PPARγ，尚需要進一步的研究證實[11-12]。關于姜黃素對OA病變的保護作用已在OA患者或動物實驗中被證實，其可以有效緩解OA病變炎癥反應及疼痛等相關臨床癥狀[13-15]，而姜黃素是否通過基于PPARγ靶點發揮保護OA病變作用，尚不清楚。本研究結果顯示，姜黃素可以明顯抑制AGEs誘導的軟骨細胞凋亡及線粒體功能的損傷；而預先給予PPARγ 特異性拮抗劑GW9662處理后，可以有效拮抗姜黃素對AGEs誘導軟骨細胞凋亡及線粒體功能損傷的保護作用；同時，本研究進一步發現姜黃素可以明顯上調AGEs誘導的PPARγ活性的降低，伴隨PPARγ相應的mRNA及蛋白表達水平的升高。該研究結果提示，姜黃素上調PPARγ的活性及表達可能為姜黃素保護AGEs誘導軟骨細胞線粒體功能損傷的重要機制之一。

綜上，本研究表明，AGEs通過下調PPARγ誘導軟骨細胞線粒體功能損傷，從而激活caspase凋亡途徑，最終導致軟骨細胞凋亡，其中線粒體功能受損可能起了關鍵作用；同時，姜黃素基于PPARγ的作用靶點，有效保護AGEs誘導的軟骨細胞線粒體損傷，抑制軟骨細胞凋亡。另外，由于AGEs形式各異、分子量大、生成易分解難、體內不易清除等特點，使得PPARγ-線粒體損傷這一通路持續活化, 并且線粒體損傷后誘發大量ROS產生，又可反過來誘導AGEs特異性作用受體RAGE的表達，從而起到正反饋的作用，這或許可以解釋為什么OA患者的病變呈持續、進行性地發展。姜黃素來源方便、經濟，長期服用安全性高，多項臨床研究已證實其可有效減輕OA患者的病理生理進展及緩解疼痛，本研究結果將為姜黃素保護AGEs所致OA病變的發生發展提供新的實驗依據。

(致謝：本研究主要在甘肅省人民醫院科研中心完成，感謝課題組成員在本研究過程中提供幫助與指導。)

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