Wnt/β-catenin抑制劑DKK1調控類風濕關節炎的研究進展

蘭維婭 唐 芳 馬武開 姚血明 盧向陽 陳琳英 李 宇

(貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002)

類風濕關節炎(RA)是一種自身免疫炎癥性疾病〔1〕。Wnt通路通過調節細胞的各個功能，如生長、發育、增殖、分化和凋亡，同時參與調控成骨、軟骨、滑膜和關節生理學等多方面的代謝調節。隨著對Wnt信號通路的深入研究，發現此信號途徑在RA患者成纖維樣滑膜細胞(FLS)異常激活和增殖、成骨/破骨細胞平衡失調、軟骨破壞和骨鈣流失中發揮著及其重要的作用〔2〕。近年來，內源性Wnt通路的負調控蛋白如Dickkopf相關蛋白(DKK)1引起極大重視，這些負調控蛋白可作為調控Wnt信號通路的潛在治療靶點。本文就Wnt/β-catenin/DKK1在RA發病機制中的調控作用進行深入探討。

1 Wnt/β-catenin信號轉導通路

Wnt信號通路根據是否有β-catenin參與分為經典通路和非經典通路，DKK1主要參與拮抗Wnt/β-catenin途徑。當該途徑被激活，分泌的Wnt蛋白與質膜上的卷曲蛋白(Fzd)在胞外區結合與低密度脂蛋白相關蛋白(LRP)5/6受體結合形成復合物，啟動和激活Wnt經典信號通路。通過激活胞內的蓬亂蛋白(Dvl)，與軸蛋白(Axin)、Frat-1形成降解復合體，抑制糖原合成激酶(GSK)-3β活性，引起底物β-catenin去磷酸化，累積的游離β-catenin 在胞質中堆積，隨后進入細胞核，β-catenin中一級結構的C末端取代轉錄抑制因子，繼而與核內轉錄協同因子T細胞因子(TCF)/淋巴增強因子(LEF)-1結合形成三元復合物，通過刺激Wnt信號下游靶基因c-myc、細胞周期蛋白(cyclin)D1、骨形態發生蛋白(Bmp)2、基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-13等的轉錄，促進成骨細胞的分裂、增殖和成熟，同時影響著破骨細胞的分化與成熟〔3～5〕。

2 DKK1蛋白結構及調控Wnt作用機制

2.1DKK1蛋白結構和生物學特征 DKK是Glinka等〔6〕在1998年研究兩棲動物非洲蟾蜍胚胎細胞中發現的，在誘導胚胎頭頸形成的過程中發揮著重要作用。DKK基因編碼分泌型糖蛋白DKK1，基因全長1 815 kb，人類的DKK1結構及生物學功能基因定位于第10號染色體 10q11上，由266個氨基酸組成，包括由31個氨基酸組成的N端信號肽段、2個半胱氨酸富集區及具有糖基化作用的C端，相對分子質量為35。在脊椎動物中，DKK家族共有4種，DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，它們具有高度同源性，其中DKK1和DKK4能抑制Wnt信號通路，但DKK4稍弱，DKK2既能活化Wnt信號通路也能起拮抗作用，而DKK3對Wnt信號通路沒有明顯的影響〔7〕。

2.2DKK1對Wnt調控機制 Wnt信號通路包括經典Wnt/β-catenin信號途徑和非經典Wnt/JNK介導的Planer細胞極性途徑、Wnt/Ca2+信號轉導途徑、Wnt/平面細胞極性(PCP)轉導途徑及Wnt/Rho途徑。DKK1主要參與Wnt/β-catenin經典途徑，拮抗其信號通路的傳導。拮抗此信號通路機制主要以下兩個方面：一方面DKK1能夠在細胞外與Wnt蛋白輔助受體LRP5/6結合，此功能缺失突變表現為由骨形成降低所造成的骨量下降〔8〕；另一方面DKK1可通過與含有Kringle結構域的Kremen受體(包括Kremen-1和Kremen-2)結合，并與LRP5/6形成DKK1-LRP-Kremen三聚體，誘導細胞發生快速內吞，形成內吞小體，從細胞膜上除去LRP5/6，最終β-catenin被磷酸化而不能與核內LEF/TCF結合，從而抑制 Wnt經典信號傳導通路〔9〕。

3 Wnt/DKK1對RA的調控

3.1Wnt信號通路調控骨代謝 當缺乏Wnt蛋白時，Wnt通路未被啟動激活，上游基因β-catenin與結腸腺瘤息肉蛋白(APC)、Axin和GSK-3β結合形成復合體，有利于酪蛋白激酶1和GSK3促進β-catenin磷酸化,這時Wnt信號通路的作用被抑制，影響成骨細胞的分裂、分化和成熟，導致骨形成不足。激活Wnt信號通路可以促進造骨細胞的骨保護素(OPG)表達上調，后者能夠抑制破骨細胞的分化而增加骨密度〔10〕。此外，Wnt信號通路組分基因被敲除(去卵巢小鼠)和通過構建轉基因鼠模型也證實了Wnt/β-catenin通路影響的分化潛能間充質前體通過壓抑過氧化物酶增殖物受體(PPAR)γ和增加關鍵成骨細胞轉錄因子的表達，引起成骨細胞的分化、復制或活動，影響骨基質的形成及鈣化等，并可影響破骨細胞的發生和骨吸收，增加骨小梁的質量和強度〔11,12〕。

3.2Wnt/DKK1對RA成骨細胞的調控 成骨細胞中Wnt經典途徑的血清DKK1抑制劑表達增強，通過結合LRP5/6 受體來抑制其轉導，從而抑制成骨細胞活性，促進成骨細胞凋亡。Liu等〔11〕研究發現，成年RA患者，血清DKK1測定明顯增高，尤其在RA活動期,且DKK1在RA不同階段表達不同生理功能，據此猜測DKK1可能作為預測RA病情進展的新指標。Daoussis等〔12〕發現，DKK1在RA系統疾病中發揮了重要作用，通過激活Wnt信號，引起下游一系列基因轉錄，且把DKK1作為骨量增減的調節器，結果發現成骨細胞分化增加，同時間接影響破骨細胞的成熟，影響著骨代謝。上述這些研究說明，RA中骨重建和骨吸收的失衡可能是由于Wnt信號通路活動被DKK1結合LRP5/6 受體起拮抗作用而造成的。

Ke等〔13〕發現，RA動物模型中使DKK1分子表達減少可以提高成骨/破骨比例、促進骨重建。相反，Heiland等〔14〕則研究發現，一些炎癥因子可以通過激活和增加DKK1進一步加速骨丟失、促進骨破壞。給RA模型小鼠注射抗-DKK1抗體，檢測其成骨細胞因子，結果發現，OPG顯著增加，骨重塑被激活，表明在小白鼠體內使用抗-DKK1藥物發生了活躍的骨重建〔15〕。Manara 等〔16〕等應用腫瘤壞死因子(TNF)-α阻斷劑抑制 DKK1發現，RA患者的骨破壞逐漸可逆轉為骨重塑，改善患者關節功能，TNF-α作為DKK1的主要誘導劑，TNF-α阻斷劑能有效的阻斷DKK1的功能。可見，Wnt信號通路通過調控成骨細胞，增加骨形成，而其抑制劑DKK1表達增加，并與LRP5/6結合，降低β-catenin水平，使成骨細胞凋亡，減少骨形成和代謝。DKK1表達上調可能成為RA成骨細胞活性抑制的主要機制，而對于RA患者中成骨細胞的Wnt信號途徑中的其他變化或是成骨細胞的其他信號通路影響還可以做更深入的研究。

3.3Wnt/DKK1對RA破骨細胞的調控 目前Wnt/β-catenin信號通路對破骨細胞的調控研究較少，其影響大多是作用于成骨細胞的基礎上間接影響破骨細胞的功能。破骨細胞的Wnt/DKK1對RA的調控是通過影響RANKL-RANK-OPG 信號調節軸間接調控骨吸收發生的，其具體機制為：成骨細胞中Wnt信號途徑的抑制因子DKK1上調，降低OPG /核因子-κB受體活化素配體(RANKL)比值，從而促進破骨細胞分化增殖，引發關節障礙。OPG是一種分泌型細胞因子，其蛋白序列類似于核因子-κB 受體活化素受體(RANK)，因此它可以通過競爭性結合RANKL，從而抑制破骨細胞的分化、成熟及破骨細胞的骨吸收作用，最終加速骨質破壞〔17〕。

在某種情況下，誘導Wnt信號通路的DKK1表達增強，減少成骨細胞特異性基因表達及OPG表達，間接增加破骨細胞生成，有利于其分化，從而造成非正常的骨質代謝；相反，DKK1阻斷Wnt/β-catenin信號通路會誘導破細胞增殖、促進骨吸收。Wang等〔18〕通過去卵巢鼠實驗發現，DKK1反義寡核苷酸處理組RANKL表達下降，抑制破骨細胞分化，進一步證實了DKK1通過抑制經典 Wnt/β-catenin 信號通路使破骨細胞基質形成和礦化減少，同時過表達DKK1的轉基因小鼠骨形成和骨量明顯減少。我們大膽猜想，通過應用DKK1的中和抗體治療RA患者，可能起到阻斷DKK1的作用，從而抑制Wnt/β-catenin 信號通路，延緩和阻止關節畸形。

4 小 結

綜上所述，骨代謝過程中，成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收保持著動態平衡，而DKK1作為Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑，通過減少成骨細胞的數量，骨量減少，并且間接誘導破骨細胞分化，骨吸收加強。盡管DKK1抑制劑調控RA患者Wnt信號通路分子機制尚未闡明，但其阻止或延緩骨代謝疾病的發生及進程的積極作用是可以肯定的。由此得出，針對成骨、破骨細胞的Wnt/β-catenin信號途徑抑制劑的抗DKK1抗體可能成為治療RA的新靶點。

1Sandoval Garrido FA,Tamiya N,Kashiwagi M,etal.Relationship between structural characteristics and outcome quality indicators at health care facilities for the elderly requiring long-term care in Japan from a nationwide survey〔J〕.Geriatr Gerontol Int,2014;14(2):301-8.

2Weivoda MM,Ruan M,Hachfeld CM,etal.Wnt signaling inhibits osteoclast differentiation by activating canonical and noncanonical cAMP/PKA path ways〔J〕.J Bone Miner Res,2016;31(1):65-75.

3Saito-Diaz K,Chen TW,Wang X,etal.The way Wnt works:components and mechanism〔J〕.Growth Factors,2013;31(1):1-31.

4Li J,Zhou XD,Yang KH,etal.Hinokitiol reduces matrix metalloproteinase expression by inhibiting Wnt/β-catenin signaling in vitro and invivo〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;23(1):85-91.

5Ueno K,Hirata H,Hinoda Y,etal.Frizzled homolog proteins,microRNAs and Wnt signaling in cancer〔J〕.Int J Cancer,2013;132(8):1731-40.

6Glinka A,Wu W,Delius H,etal.Dickkopf-1 is a member of a new family of secreted proteins and functions in head induction〔J〕.Nature,1998;391(6665):357-62.

7Niehrs C.Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators〔J〕.Oncogene,2006;25(57):7469-81.

8Korvala J,Juppner H,Makitie O,etal.Mutations in LRP5 cause primary osteoporosis without features of OI by reducing Wnt signaling activity〔J〕.BMC Med Genetics,2012;13(1):26.

9Kristensen IB,Christensen JH,Lyng MB,etal.Expression of osteoblast and osteoclast regulator y genes in the bone marrow microenvironment in multiple myeloma:only up-regulation of Wnt inhibitors SFRP3 and DKK1 is associated with lytic bone disease〔J〕.Leuk Lymphoma,2014;55(4):911-9.

10Albers J,Keller J,Baranowsky A,etal.Canonical Wnt signaling inhibits osteoclastogenesis independent of osteoprotegerin〔J〕.J Cell Biol,2013;200(4):537-49．

11Liu YY,Long L,Wang SY,etal.Circulating Dickkopf-1 and osteoprotegerining rhrumatoid arthritis〔J〕.Chin Med J (Engl),2010;123(11):1407.

12Daoussis D,Andonopoulos AP.The emerging role of Dickkopf-1 in bone biology:is it the main switch controlling bone and joint remodeling〔J〕?Semin Arthritis Rheum,2011;41(2):170-7.

13Ke HZ,Richards WG,Li X,etal.Sclerostin and Dickkopf-1 as therapeutic targets in bone diseases〔J〕.Endocr Rev,2012;33(5):747-83.

14Heiland GR,Zwerina K,Baum W,etal.Neutralisation of Dkk-1 protects from systemic bone loss during inflammation and reduces sclerostin expression〔J〕.Ann Rheum Dis,2010;69(12):2152-9.

15Glantschnig H,Scott K,Hampton R,etal.A rate-limiting role for Dickkopf-1 in bone formation and the remediation of bone loss in mouse and primate models of postmenopausal osteoporosis by an experimental therapeutic antibody〔J〕.J Pharmacol Exp Ther,2011;338(2):568-78.

16Manara M,Sinigaglia L.Bone and TNF in rheumatoid arthritis:clinical implications〔J〕.Rmd Open,2015;1(Suppl 1):e000065.

17Boyle WJ,Simonet WS,Lacey DL.Osteoclast differentiation and activation〔J〕.Nature,2003;423(6937):337-42.

18Wang Y,Li YP,Paulson C,etal.Wnt and the Wnt signaling pathway in bone development and disease〔J〕.Front Biosci(Landmark Ed),2014;19(3):379-407．