基于細菌相關特性的抗腫瘤措施

肖建華 游 艷 董自強

(三峽大學第一臨床醫學院泌尿外科 三峽大學泌尿外科研究所，湖北 宜昌 443003)

腫瘤致死率高一方面因為多數腫瘤患者早期缺乏典型的臨床表現卻病程進展迅速，在現有的科學技術水平上不能很好地做到早發現，早診斷和早治療；另一方面，與目前常用的治療腫瘤的臨床方法有限密切相關。目前臨床治療腫瘤的方法多為以手術為主的綜合治療，多數晚期腫瘤難以根治性切除，且為盡可能治療徹底，術后往往需要長周期、大劑量的化學藥物治療，常用化療藥物在抑制腫瘤細胞的同時對機體正常細胞也產生了不可逆的損傷，給本身虛弱的身體帶來重創，治療效果普遍欠佳。近些年來涌現出了包括光動力療法，基因療法，端粒酶治療和細菌療法等多種實驗癌癥療法〔1〕。其中，細菌療法以其選擇性腫瘤內復制和積累，攜帶表達多種治療性蛋白的能力及能夠被抗生素消除等優勢成為腫瘤治療新戰略的研究熱點〔2〕。本文擬就基于細菌相關特性的抗腫瘤措施研究進展進行綜述。

1 腫瘤細菌療法的發現

有目的地讓腫瘤患者感染細菌以治療腫瘤在很早之前就有報道〔3〕。美國一位醫生注意到1例頸部腫瘤患者在感染丹毒后腫瘤逐漸恢復。他開始利用細菌及其毒素治療終末期腫瘤，并用殺死后的化膿性鏈球菌和黏質沙雷菌治療肉瘤、癌、淋巴瘤、黑色素瘤和骨髓瘤，多例惡性腫瘤的進展被明顯延遲〔4〕。較大體積的實體腫瘤中心區域氧分壓和氧氣濃度明顯低于正常組織，恰好適應部分厭氧細菌的正常生長，為后續利用細菌作為溶瘤藥物提供一定的理論基礎。從此，探討細菌本身及其代謝產物對各類腫瘤的作用，細菌對腫瘤的靶向定植，細菌同傳統腫瘤治療方法的聯合引用，細菌作為抗腫瘤藥物、細胞因子、基因載體及各類用于腫瘤治療細菌性能的優化等方面的研究課題不斷涌現。

2 細菌本身及其代謝產物的直接抗腫瘤作用

2.1細菌作為腫瘤殺傷劑 正常狀態下，人體不同部位均有大量寄生菌存在，這些細菌在從人體吸取營養的同時也發揮著促進人體健康的作用。雙歧桿菌、乳酸菌等腸道正常細菌可以促進腸道功能的成熟，幫助消化和吸收，產生維生素，維持能量代謝平衡，調節腸道黏膜免疫系統，防止腸道感染〔5〕，在一定程度上可以抑制腫瘤形成。而且，雙歧桿菌、梭狀芽孢桿菌等厭氧菌則能夠選擇性定位于實體腫瘤組織中的低氧濃度和低氧分壓環境并迅速繁殖，Fujimori〔6〕在制造肺癌、黑色素瘤和乳腺癌老鼠模型的基礎上經鼠尾靜脈注射長雙歧桿菌一定時間后在每克腫瘤組織中檢測出高達6×104CFU細菌量，同一動物的肝腎脾肺等正常組織中細菌數量低于可檢測水平；同樣，在7，12-二甲基苯并〔a〕蒽(DMBA)誘發的乳腺腫瘤模型中得到了類似的結果，這一特性使得細菌不斷以極具潛力的抗腫瘤因子出現。但致病性細菌往往在導致腫瘤縮小的基礎上會伴隨急性毒性導致腫瘤模型死亡，從而使研究重點集中在了非致病性細菌身上。Yazawa等〔7〕證實在大鼠中誘導的乳腺腫瘤，經尾靜脈注射雙歧桿菌后，雙歧桿菌能特異性地在腫瘤組織中繁殖擴散傳播，導致腫瘤組織的萎縮和延長荷瘤大鼠的生存。梭狀芽孢桿菌novyi展示出明顯的抗腫瘤作用，但致死率也非常高，而經減毒刪除編碼致死毒素基因后則效果理想〔1〕。VNP20009，刪除-msbB和purl-基因后減毒鼠傷寒沙門氏菌菌株的衍生物避免了毒性休克的發生，依賴腫瘤組織嘌呤表現出持久廣泛的抗腫瘤功效，甚至能夠針對轉移病灶，目前已進入Ⅰ期臨床試驗〔1〕。在美國一項囊括4例黑色素瘤和腎癌的Ⅰ期臨床試驗中將減毒沙門氏菌VNP20009經靜脈注入后在其中3例患者腫瘤組織中檢測出細菌〔8〕。細菌除了可以單用作為抗腫瘤措施外還可以其同其他腫瘤治療方法聯合以作為其他抗腫瘤措施的增敏劑。C.novyi NT加單劑量脂質體阿霉素被證實可以根除荷瘤小鼠腫瘤，同時，其同抗微管藥物如HTI-286和長春瑞濱組合協助改變腫瘤區域的血供情況以促進治療藥物有效到達目的地或擴大腫瘤組織缺血缺氧區域以利于厭氧菌的繁殖，進一步改善各化療藥物的抗腫瘤效果〔9〕。目前，尚處于研究階段的新型抗腫瘤細菌菌株還包括豬霍亂沙門菌，霍亂弧菌，李斯特菌和大腸桿菌等。

2.2細菌孢子 大多數厭氧菌均可以形成孢子，且一旦他們遇上有利的條件，如腫瘤內部的壞死區，孢子便可以發芽茁壯成長，同樣其被研究用于腫瘤靶向治療，且將部分孢子進行基因修飾后還可避免過多的毒副作用。小鼠腫瘤模型瘤內注射C.histolyticum和C.sporogenes孢子后可以明顯觀察到腫瘤組織的崩解。重組后的梭狀芽孢桿菌孢子免疫原性低，并不引發免疫反應，4次重復注射11 d后仍然可以顯示出明顯的抗腫瘤活性〔10〕。C.novyi NT孢子同傳統的化療藥物如海兔毒素-10，絲裂霉素C，長春瑞濱和多西紫杉醇的組合同樣顯示出協同抗腫瘤特性。此外，腫瘤的動物模型實驗還證實細菌孢子可以增強放射療法，放射免疫療法的療效〔11〕。此外，細菌孢子也有被研究作為抗腫瘤藥物、細胞毒性肽，治療性蛋白質的傳遞系統和基因療法的載體。

2.3細菌毒素 細菌毒素可以殺死細胞或調節細胞的代謝過程如增殖、凋亡和分化等，同樣具有一定的抗腫瘤活性，可用于腫瘤治療或以其為基礎研制用于腫瘤治療的免疫毒素〔12〕。白喉毒素(DT)可以結合到表達肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)前體的細胞表面并通過網格蛋白小泡內吞而被吸收介導具有催化活性的白喉毒素片段A生成，進一步催化延伸因子(EF)-2導致蛋白質合成受抑制，繼發細胞裂解和(或)誘導細胞凋亡。同樣，綠膿桿菌外毒素A通過該通路導致蛋白質合成受抑制，發揮抗腫瘤作用，使其成為潛在的腫瘤靶向治療候選措施〔13〕。產氣莢膜梭菌A型菌株產物腸毒素(CPE)純化后可對胰腺癌、結腸癌、乳腺癌和胃癌細胞產生急性細胞毒作用，導致腫瘤壞死，抑制體內腫瘤的生長〔14，15〕。黃色葡萄球菌α-毒素，百日咳桿菌AC毒素，志賀樣毒素，霍亂毒素分別作用于間皮瘤細胞(P31)和小細胞肺癌細胞(U-1690)的初步結果表明增加毒素劑量則細胞毒性相應增加，毒素可以明顯增加腫瘤細胞凋亡的發生〔16〕。為了避免綠膿桿菌外毒素、DT等本身的高毒性，常將其結合到一些共軛細胞結合蛋白或通過轉基因或重組毒素，刪除或替換編碼毒素結合區的核酸以提高其對腫瘤細胞的選擇性，降低對正常細胞的損傷。共軛結合有白細胞介素(IL)、粒細胞集落刺激因子、巨噬細胞集落刺激因子、轉鐵蛋白、表皮生長因子等的細菌毒素已逐漸進入臨床試驗階段，具有一定的研發前景。重組IL4-綠膿桿菌外毒素(IL-4-PE)在裸鼠體內實驗中已經證明對人腦膠質瘤腫瘤模型具有顯著的抗腫瘤活性。瘤內給藥IL-4-PE用于治療惡性星形細胞瘤目前正已進入Ⅰ期臨床試驗〔17〕。另外，細菌毒素還可以增加腫瘤細胞對其他抗腫瘤療法的敏感性，如肉毒桿菌毒素可通過促進腫瘤血管開放而使癌細胞對放療和化療更有效。

3 細菌介導的腫瘤免疫治療

腫瘤生長于機體，同樣接受全身免疫系統的監視，但可能由于其免疫原性過弱導致其被機體當做自身抗原逃避免疫系統的破壞，試想如能利用可行的刺激增加腫瘤細胞的免疫原性，激活自身免疫系統對其排斥和殺傷或許可以起到很好的抗腫瘤效果。因此，基于細菌相關特性的腫瘤免疫療法逐漸興起。減毒S.鼠傷寒沙門菌仍具侵入性，體內外均可感染惡性細胞并觸發免疫反應，表達小鼠細胞因子基因工程減毒菌株可顯著調節感染免疫力，滯后黑色素瘤的生長能力〔18〕。一種攜帶編碼人類腫瘤血管內皮標記物(TEM)8異種核酸疫苗的減毒鼠傷寒沙門菌口服后可誘導TEM8特異性CD8毒性T細胞反應，抑制腫瘤血管生成，發揮抗瘤作用〔19〕。C.novyi-NT孢子單獨作用后可誘導大量白細胞聚集，產生IL-6等細胞因子，引發炎癥反應，通過生成的活性氧，蛋白酶及其他降解酶直接對腫瘤細胞構成破壞，同時還可啟動強有力的細胞免疫反應破壞殘余的腫瘤細胞；同其他藥物如抗微管劑結合也表現出協同的抗腫瘤作用〔20〕。此外，經相應處理后的細菌可用于傳遞腫瘤疫苗，重組李斯特菌單核細胞疫苗株(LM-NP)在臨床前期已顯示出強大的抗腫瘤效能；另有研究表明重組李斯特菌菌株LM-LLO-E7可以有效治療多數荷瘤小鼠，且LM-LLO-E7作為宮頸癌免疫治療的研究已進入臨床試驗階段〔21〕。結核分枝桿菌的細胞壁骨架牛卡介苗(BCG-CWS)已經作為一種有效的佐劑用于各種癌癥患者的免疫治療，在結腸癌細胞中表現出明顯的放射增敏作用〔22〕，這些研究結果均表明了非劇毒細菌作為腫瘤免疫治療劑的巨大潛能。

4 細菌作為傳遞系統

缺氧和壞死是大多原發或轉移性實體腫瘤的典型特征，應用氧電極測試腫瘤組織中氧分壓的中位數10～30 mmHg，很多區域讀數甚至低于2.5 mmHg，而正常組織中氧分壓24～66 mmHg〔23〕，如此一來，科研者們便嘗試利用非致病性專性或兼性厭氧細菌來選擇性識別腫瘤組織中的厭氧條件，Kimura等〔23〕將雙歧桿菌經尾靜脈注入荷瘤小鼠體內后反復觀察到細菌在48～96 h內從正常組織和器官中消失，而僅在腫瘤組織中生長。這樣就使得一些厭氧細菌，如梭狀芽胞桿菌，營養缺陷型細菌，如沙門菌，被研究作為腫瘤治療措施中的遞送載體。

4.1酶前體藥物治療 Fujimori〔6〕構建能夠表達胞嘧啶脫氨酶的質粒pBLES100-S-eCD并經長雙歧桿菌靶向導入實體腫瘤組織中，然后為轉移性乳腺癌患者大劑量全身應用較5-氟尿嘧啶毒性低的5-氟胞嘧啶，從而使胞嘧啶向尿嘧啶的轉化僅僅發生于有胞嘧啶脫氨酶生成的實體腫瘤組織中而避免高濃度的5-氟尿嘧啶分布到正常組織中以克服化療毒副作用，同樣的處理系統在多種免疫缺陷裸鼠體內移植的人類腫瘤中均已被成功確認有效。Fox等〔24〕通過實驗證實其設計的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌同樣為非常有效的酶前體藥物治療措施，且其表達效果在血管靶向劑考布他汀A-4磷酸的作用下顯著增強，同樣，沙門菌也被結合了硝基還原酶和胞嘧啶脫氨酶并證實抗腫瘤效果確切。表達大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶的鼠傷寒沙門菌體可選擇性將抗腫瘤藥物導向固體腫瘤發揮抗腫瘤作用，且其活性較前體藥物聯合更昔洛韋更高。沙門菌還可與一種將芥菜前體藥物轉化為核酸交聯劑的酶，羧肽酶(CP)G2結合，體內用藥后腫瘤中可檢出高度活性〔25〕。在一項臨床試驗中將攜帶胞嘧啶脫氨酶的減毒沙門菌VNP20009直接接種到難治性腫瘤瘤內同時口服化療藥物5-氟胞嘧啶，可抑制38%～79%的腫瘤增長效應且細菌并不在身體中播散〔26〕。

4.2基因治療 候選治療基因導入細菌后選擇性在腫瘤細胞間繁殖，此時，治療基因并未導入腫瘤細胞，只是其編碼產物-治療性蛋白產生并釋放于腫瘤細胞中發揮其抗腫瘤作用〔27〕。將厭氧嬰兒雙歧桿菌介導的胸苷激酶(BI-TK)自殺基因治療系統應用于N-甲基-亞硝基脲灌注法誘導的大鼠膀胱腫瘤模型后成功發現用BI-TK/GCV治療組的caspase-3凋亡蛋白表達水平和腫瘤細胞凋亡率明顯高于空質粒組和生理鹽水組，膀胱腫瘤負擔則顯著低于生理鹽水對照組〔28〕。人(h)IL-12，人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(hGM-CSF)，鼠(m)IL-12和鼠(m)GM-CSF基因被克隆到營養缺陷型鼠傷寒沙門菌SL3261上，其表達受巨細胞病毒(CMV)啟動子控制，研究證實口服表達mGM-CSF或mGM-CSF加mIL-12的沙門菌可以引起Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤消退。傳遞表達IL-2基因的鼠傷寒沙門菌、表達腫瘤壞死因子的VNP20009和丙酮丁醇梭菌和作為抗血管生成蛋白內皮抑素的傳遞系統逐漸被納入研究以驗證不同細菌作為基因治療載體的可行性〔29〕。姜宏華等〔30〕通過實驗驗證了經基因改造的大腸桿菌DH5對裸鼠結腸癌肝轉移的治療效果由雙歧桿菌細菌傳遞shRNA的系統〔31〕也已被考慮，但是，有效向癌細胞轉移shRNA的裝置仍然需要進一步研究。

此外，Liu等〔32〕還通過工程腺病毒載體改變了細菌的感染去向后使用在腫瘤表面存在特有配體的陽離子脂質體和不明機制卻可以在腫瘤中優先積累的活減毒沙門菌克服了治療基因在原發腫瘤組織中分布不均和轉移灶過多而無法一一注射的問題。

綜上，借助于腫瘤組織中的缺氧區域使厭氧細菌選擇性集中生長而發揮作用，這就要求腫瘤組織中存在足量的壞死區域。而早期的原發瘤灶或遠處轉移瘤往往體積小，血供較豐富，難以實現細菌介導的針對性治療。同時，較大體積的腫瘤組織僅中心區域缺氧、壞死較重，同正常組織交界區血供常相對充分，基于細菌措施不可能實現完整的腫瘤溶解。再者，難以確定全身應用的細菌劑量，增大劑量則容易導致感染性疾病或其他毒性反應，減小劑量則致藥效減弱，不能達到理想的治療效果。因此，即使后續的大規模多中心研究證實上述各項措施效果確切，安全可靠且臨床可行性強，單獨應用多不能實現理想效果，需進一步探究各措施同傳統腫瘤治療措施的聯合應用、新的改進方案或抗腫瘤措施，以期更好地控制藥物劑量、施藥方法、毒副反應和治療效果。

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