植物新品種DUS測試中近似品種的篩選方法

王紅娟 林清 蔣曉英 白文欽 官玲 吳紅

摘 要 隨著新版《種子法》的實施和植物新品種保護權收費的停征，植物新品種權的申請量逐年增長，植物品種特異性、一致性和穩定性（DUS）測試機構的工作量大幅增加。近似品種是特異性判定的基礎，快速準確篩選近似品種是DUS測試工作高效有序開展的重要保證。綜述DUS測試中篩選近似品種的信息來源和篩選途徑，有助于品種測試機構提高DUS測試的效率，縮短植物新品種權的授權周期。DNA分子標記因其諸多優點在近似品種篩選和特異性判定中發揮著重要的作用，最后提出未來DNA分子標記研究的3個方向，為測試機構和育種家開展相關工作提供參考。

關鍵詞 近似品種 ；特異性 ；技術問卷 ；DNA指紋 ；已知品種數據庫

中圖分類號 S338 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.10.009

Abstract With the implementation of the new edition of "Seed Law" and cessation of new plant variety right fee， the number of applications for new plant variety right has been increasing each year， resulting in substantial increase of the workload of DUS testing station. Similar variety is the base for the examination of distinctness of a variety. Quickly and accurately screening of similar varieties is an important guarantee for the efficient conduction of DUS testing. The data sources and ways of selection of similar varieties in the DUS testing were summarized， which would help the Station to improve efficiency of DUS testing and then shorten the period of authorization of new plant variety rights. The molecular markers are playing an important role in the similar variety selection and distinctness assessment. Three research directions of molecular markers for future research were put forward to give some hints to DUS test stations and breeders in the future work.

Keywords similar variety ； distinctness ； technique questionnaire ； DNA fingerprinting ； database for known varieties

中國于1999年加入國際植物新品種保護聯盟（UPOV），履行1978年公約文本[1-2]。在中國，申請品種權的植物新品種應當在中國植物品種保護名錄范圍內，且應當具備新穎性、特異性、一致性和穩定性，并具有適當的名稱[3]。植物新品種特異性（Distinctness）、一致性（Uniformity）和穩定性（Stability）測試，簡稱DUS測試。2016年1月1日開始實施的修訂版《種子法》規定，DUS測試是申請植物新品種權、主要農作物品種審定和非主要農作物品種登記等品種管理的基本技術依據。隨著中國植物育種者品種權意識的不斷增強和新品種保護權收費的停征，申請新品種保護的植物種類和品種數量呈逐年增長趨勢（圖1），僅2016年一年的申請量達2 523件，居UPOV成員第二位；2017年申請量則躍升至3 842件，預計能居UPOV成員首位。同時，申請品種審定和登記也要求出具DUS測試報告。因此，國內DUS測試機構的工作量大幅增加。

特異性審查是DUS測試的關鍵環節。根據UPOV公約，一個品種明顯區別于申請時其他任何已知品種，則認為該品種具有特異性。在實際測試中，把申請品種與所有已知品種進行對比往往不現實。通常的解決方法為從已知品種中篩選出相關形態特征與申請品種最為相似的品種，即近似品種（Similar Varieties），通過種植試驗與申請品種相鄰種植進行性狀比較。近似品種的選擇是DUS測試的重要環節，直接影響DUS測試特異性的判定。近似品種選擇不合理，往往會導致測試機構的工作量增加，貽誤申請審批進程。滕海濤等[4]概述了近似品種的選擇依據和方法，有較好的科普意義和指導作用。本文綜述篩選近似品種的信息來源和篩選途徑，有助于測試機構判定申請品種的特異性，提高DUS測試的效率，縮短新品種權申請的授權周期。

1 篩選近似品種的信息來源

1.1 申請者提供的技術問卷

育種家申請品種保護時需要填寫技術問卷，提供申請品種的重要信息（表1）。這些信息對于DUS測試第一個周期的近似品種篩選非常重要。其中起作用最大的是品種的分組性狀（Grouping characteristic）。但是，只有當申請者提供的品種信息準確無誤，利用這些信息才能篩選到準確的近似品種。事實上，育種家往往更關注和經濟價值相關的農藝性狀，對一些常見的DUS測試性狀如“花青甙顯色強度”等性狀缺乏觀測經驗，對表達狀態的判斷很可能存在較大偏差。那么，要想充分發揮技術問卷信息在近似品種篩選中的重要作用，一方面，需要育種家咨詢DUS測試員或者植物學家等相關人員盡可能提供準確的品種描述信息；另一方面，DUS測試員在利用技術問卷信息篩選近似品種時，應能夠預見到某些性狀的表達狀態描述可能不準確，從而設置較大的篩選范圍或者排除這些性狀，甚至在設計技術問卷性狀時避免使用這類性狀。

1.2 DUS測試數據

利用技術問卷中有限的信息通常會篩選到較多的近似品種。在完成第一個生長周期的測試后，測試員可以獲得申請品種所有測試性狀的數據，包括分組性狀。利用這些數據，首先可以驗證申請人提供的技術問卷信息是否準確；其次可以重新篩選更相近的近似品種，用于第二個測試周期（圖2）。同時，申請品種在相同地點相同的試驗條件下進行測試，獲得的性狀數據可比性更強，相互之間也可以比較篩選近似品種。

1.3 DNA數據

隨著新一代測序技術的迅速發展，水稻、玉米、小麥等許多作物的基因組、EST或轉錄組數據相繼被釋放。利用這些數據可以篩選SSR等分子標記，輔助DUS測試。如李汝玉等基于谷子[5]和大白菜[6]全基因組序列分別開發30對和17對SSR核心引物，這些引物在基因組中分布均勻，多態性好，擴增重復性好，可以用于谷子和大白菜的遺傳多樣性分析和品種鑒定等領域。SSR分子標記因其諸多優點，是UPOV官方認可的構建DNA指紋數據庫的理想標記之一，UPOV制定了相應的技術文件指導其應用[7]。SSR標記在近似品種篩選和品種特異性判定中應用最為廣泛[8-15]。如賴運平等[13]利用篩選出的49對SSR引物對80份甘藍型油菜品種的遺傳相似系數進行分析，論證了利用SSR標記篩選近似品種的可行性。張晗等[15]利用21對核心引物和21對擴展引物對36個小麥品種進行擴增，計算兩兩品種之間的分子距離，當分子距離小于0.2時，判定為近似品種。該方法具有諸多優點，除了標記多態性豐富、不受環境條件影響，還具有檢測便捷、重現性好等優點，可以節約DUS測試的時間和經濟成本，已成為國內外許多植物近似品種篩選的重要手段。

2 篩選近似品種的途徑

2.1 利用已知品種表型性狀數據庫進行篩選

農業植物品種DUS測試體系已建立統一的自動化辦公平臺和已知品種表型性狀數據庫（http：//www.cnpvpdus.cn/DUS/）。測試員可以利用技術問卷中的品種類型和分組性狀，以及第一測試周期采集的其他性狀進行近似品種篩選（圖2）。系統提供了3個供篩選的數據庫：已知品種庫、測試數據庫和技術問卷庫，分別對應已經獲得授權的申請品種和公知共用的已知品種、安排了測試的申請品種及其近似品種、以及育種家提交申請時技術問卷中填寫的性狀數據。測試員應當在3個數據庫中逐一篩選近似品種，避免遺漏。在第一個測試周期之前，先利用技術問卷中的信息進行初步篩選。其中，品種類型信息用來對品種分組，再利用分組性狀在屬于相同分組的品種中篩選近似品種。第一個測試周期之后，利用采集的性狀信息再次篩選更近似的品種。此外，測試員應根據經驗對篩選結果進行分析，保留準確又盡可能少的近似品種。例如，某品種和申請品種在分組性狀或者一些重要的農藝性狀上表現為近似，則應保留為近似品種。

DUS測試分中心亦可構建所在生態區的已知品種表型性狀數據庫，如濟南分中心自2000年開始對黃淮海地區主要農作物品種進行表型性狀數據采集，建立了黃淮海地區大豆[16]、玉米[17]等作物的參照品種數據庫，其中包括3 696份玉米品種。受到環境條件、性狀類型和觀測人員的影響，同一品種同一性狀的表達狀態代碼會發生波動。孫加梅等[17]通過對鄭單958等12份品種不同年份性狀表達狀態代碼的波動幅度的研究，將性狀分為4個穩定性類別（表2），并據此制定了近似品種篩選時不同性狀每個代碼的篩選范圍，建立了基于表型性狀的個性化近似品種篩選方法，取得了較好的效果。

2.2 利用DNA指紋數據庫進行篩選

農業農村部已經發布水稻等16種農業植物基于SSR標記的品種鑒定技術規程農業行業標準，并采用標準中的SSR標記，構建了水稻、玉米、小麥、大白菜等作物的DNA指紋數據庫，已經具備利用DNA指紋數據篩選近似品種的條件。濟南分中心利用小麥已知品種DNA指紋數據庫對其2013～2017年測試的小麥品種進行近似品種篩選，把與申請品種間的遺傳距離小于0.2（或5個位點）的已知品種作為近似品種，與申請品種一起在田間種植比較。相較于常規利用表型性狀的篩選方法，該方法篩選出的近似品種數量減少了約一半，提高了近似品種選擇的準確性，縮短了一年的測試周期，降低測試成本。國外的測試機構也將DNA指紋數據用于油菜、辣椒、萵苣、玉米、小麥等作物的近似品種篩選和特異性判定[18-22]。

DUS測試依據的是表型性狀，但是植物性狀的表達極為復雜，品種間的遺傳相似性和表型相似性高度相關但并非是線性關系。也就是說，SSR基因型不同的品種可能表達出相同的表型性狀，反過來，SSR基因型相同的品種形態性狀可能存在明顯差異。因此，通常在第一個測試周期之前利用分子指紋數據篩選近似品種，然后利用第一個測試周期獲得的表型性狀進行驗證，進一步縮小近似品種的范圍（圖2）。

2.3 排除法

一些品種如玉米雜交種由于育種目標的趨同化等原因，可能篩選到較多的近似品種。第一個測試周期后，利用GAIA法[23]可以排除一部分不近似的品種，以節約第二個測試周期的人力和物力成本（圖2）。GAIA法的原理是對第一個測試周期獲得的每個有差異的性狀進行加權從而計算每對品種之間的表型距離。如果該距離大于“特異性+”（Distinctness Plus）閾值[24]，表明該品種與申請品種有明顯差異，不需要在第二個生長期繼續種植。“特異性+”閾值的設定對測試員的要求比較高，只有熟悉該作物且DUS測試經驗豐富的測試員才能設定合適的閾值。該閾值高于判定特異性所需的閾值水平，以確保達到或者超過該閾值的品種確實有明顯差異。

另一方面，育種人提交品種保護申請時，需要提交申請品種的代表性照片。照片提供的信息非常明確，如顏色分布、形狀、株形等信息，測試員可以利用這些照片排除明顯不近似的品種。該方法對觀賞植物近似品種的篩選和排除更為有效，但需要注意照片的拍攝質量及照片對性狀反映的真實性問題[25]。DUS測試主管部門已經制定水稻、玉米、花生和甘藍型油菜等農業植物新品種DUS測試性狀照片拍攝規范[26-29]，育種家可以參考拍攝規范進行照片拍攝。

3 展望

目前，表型性狀仍是篩選近似品種的主要依據。需要注意的是，受生態環境和不同測試指南版本的影響，在不同地點或者不同生態區測試的品種，以及測試年度跨度較大的品種相比較時，可能篩選出不合適的近似品種，應當謹慎對待。因此，加強已知品種數據庫的更新與維護，建立完善的已知品種數據庫非常重要。為此，應當長期開展已知品種的信息采集和整理工作，對于數據庫中已有但是其性狀信息采集時間較為久遠的品種，應當重新采集其性狀信息，完善和更新數據庫。這對各測試分中心篩選合適的近似品種非常重要。

分子標記在DUS測試中的應用越來越廣泛，尤其是應用于輔助一致性和特異性判定。利用SSR等分子數據篩選近似品種具有標記豐富、操作便捷、快速準確、不受環境條件影響等諸多優點。未來，分子方法篩選近似品種將成為DUS測試技術發展的必然趨勢。以下3個方面應作為重點研究的方向：（1）分子標記的選擇。使用的分子標記應隨機并均勻分布于植物的基因組中。除了SSR這類以PCR擴增為基礎的第二代分子標記，還應開發更多的尤其是以DNA測序為核心的第三代分子標記，如功能基因標記[30]和SNP[31]等。Jamali等[30]引入水稻籽粒長度、淀粉含量、香味和糊化程度的功能基因標記，結果顯示除糊化程度外，其余3個功能基因標記能夠很容易地將品種劃分為不同分組，也能夠對品種進行特異性評估。法國品種審定和種子檢測中心（GEVES）已將SNP分子標記應用于玉米自交系DUS測試近似品種的篩選和玉米品種庫的更新[25]。（2）數據庫的構建與完善。構建已知品種的DNA分子數據庫應至少設置兩組平行試驗，取結果相同的數據入庫。并驗證數據庫的質量，保證建成的數據庫錯誤率低于0.5%。（3）篩選閾值的確定。有研究認為，當樣品間差異位點數目≤2時，可判定為近似品種[32]。但是，差異位點數目和使用的標記數量有密切關系，籠統地規定≤2個位點顯然不合理。張晗等[15]設置的閾值為遺傳距離<0.2（或5個位點），對于提高小麥近似品種的篩選效率起到了一定作用。UPOV提出利用傳統性狀的最小距離校正分子性狀的閾值水平。在該模式下，法國測試機構綜合利用GAIA表型距離和分子距離，規定表型距離>6，或者表型距離為2-6且分子距離>0.2的品種對判定為具有明顯差異（http：//www.upov.int/meetings/en/topic.jsp？group_id=262）。此外，設置閾值時還應當考慮品種的不同類型（自交系、常規種、雜交種、綜合品種、群體等）。

值得一提的是，不少國家由申請人提供近似品種，測試機構不再進行篩選。相比測試員，申請人更熟悉申請品種的育種過程及其特征特性，清楚哪些品種與自己的品種更相似。因此，這種做法更加科學。國內的測試機構也要求申請人提供近似品種，陳紅[33]詳細闡述了申請人填寫品種權申請文件時如何選擇近似品種并恰當地陳述理由，對申請人有較好的指導意義。但由于申請人或對近似品種的理解不準確，或誤當作品種區域試驗的對照品種，或抱著僥幸心理，提供的近似品種需要測試員鑒別和確認。因此，僅靠申請人提供近似品種目前并不可行，仍需要測試機構利用表型性狀和分子標記篩選近似品種。

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