北美H7亞型禽流感病毒SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法的建立

王晨曦,張谞霄,蒲 娟,孫洪磊

(中國農業大學動物醫學院， 北京 海淀 100193)

禽流感是由禽流感病毒(AIV)引起的禽類高度接觸性傳染病。根據該病毒對雞的致病性，可將其分為低致病性禽流感(LPAI)病毒和高致病性禽流感(HPAI)病毒。目前認為，HPAI主要由H5和H7亞型引起[1]。其中H7亞型AIV已在全球多個地區中發現，不僅波及的國家和地區較廣，而且暴發的亞型多樣，對人類健康也有嚴重的威脅，特別是新型H7N9流感病毒感染人的報道更是引發了人們的廣泛關注。

根據血凝素(HA)基因的分子遺傳進化特點，H7亞型AIV可以分為歐亞和北美兩個進化分支，我國自然分離到的H7亞型AIV均屬于歐亞分支[2]。在美國，LPAI和HPAI H7亞型均在家禽中暴發，并造成嚴重的經濟損失。同時，北美分支的H7亞型流感病毒也多次引起人類感染發病[3-5]。研究表明，與歐亞分支的H7亞型AIV相比，北美分支的H7亞型AIV獲得了更強的α-2,6唾液酸糖苷結合能力，而α-2,6唾液酸糖苷為人類上呼吸道主要分布的流感病毒受體，因此推測該類病毒具有更強的跨物種感染能力[6]。同時動物實驗也證實，部分北美分支H7亞型AIV能夠在哺乳動物模型雪貂間發生有效的接觸傳播，在人際間流行的可能性更大[6]。因此，北美分支H7亞型AIV的公共衛生學意義值得關注。

截至目前，我國尚未有人或禽類感染北美H7亞型流感病毒的報道，但是頻繁的禽產品貿易交流以及候鳥遷徙都可能將北美源H7亞型AIV傳入我國。我們之前的研究已經建立了針對北美H7亞型AIV HA基因的RT-PCR檢測方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，適合基層實驗室應用[7]。實時熒光定量PCR能夠實現對模板的定量，具有特異性好、靈敏度高、結果直觀、重復性高等優點，已廣泛應用于流感病毒的檢測[8-9]。因此，建立北美H7亞型AIV實時熒光定量PCR檢測方法，能夠為監測北美源H7 亞型AIV入境傳播提供更加準確、有效的工具。

1 材料與方法

1.1 質粒與病毒 北美H7亞型流感病毒A/New York/107/2003 (H7N2) HA基因質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。A/duck/Anhui/D293/2014 (H3N2)、A/chicken/Shandong/16/05 (H9N2)、新城疫病毒(LaSota) 和雞傳染性支氣管炎病毒(H12) 由本實驗室分離和/或保存。H5N1 AIV、歐亞分支H7N2和H7N9病毒抗原，購自哈爾濱維科生物制品有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購自Roche公司；SYBR Green PCR Master Mix，購自Applied Biosystems公司；反轉錄流感特異性引物為Uni 12 :5′-AGCAAAAGCAGG-3′，由北京擎科新業生物技術有限公司合成；反轉錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit′，購自Promega公司。

1.3 引物設計與合成 參照GenBank已發布的H7亞型AIV血凝素(HA)基因序列，利用MEGA 6和 Primer Premier 5.0針對北美源H7亞型AIV保守區域設計引物。引物序列分別為， F:5′-AATCACTAGGAGTCCAGAGTGATGC-3′；R: 5′-AGTTCTAGAGTTGATGTTTTGGAAT-3′，預期擴增片段115 bp。引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。

1.4 總RNA提取及反轉錄 使用Roche RNA提取試劑盒分別提取H3N2、H5N1、H7N2、H7N9和H9N2亞型流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的總RNA。按照試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA，用于PCR擴增。

1.5 重組質粒標準品的制備 A/New York/107/2003(H7N2) HA目的基因的PCR擴增、連接、轉化和鑒定等均按照常規方法進行。陽性重組菌液由北京擎科新業生物技術有限公司進行序列測定。將鑒定正確的陽性菌液擴大培養，提取重組質粒，分光光度計測量重組質粒濃度，-20 ℃保存。

1.6 實時熒光定量PCR反應體系 在20 μL反應體系中加入 SYBR Green PCR Master Mix (2×)10 μL、引物F 0.5 μL、引物R 0.5 μL、模板2 μL，加雙蒸水至20 μL。

1.7 標準曲線的建立 將構建的重組質粒進行10倍倍比稀釋，取1.0×108- 1.0×103Copies/μL作為標準品，進行實時熒光定量PCR反應建立標準曲線，并設置陰性對照NTC。

1.8 特異性試驗 用建立的實時熒光定量RT-PCR方法分別對北美H7N2 AIV HA質粒，及歐亞分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進行檢測，并設置陰性對照，以評價該方法的特異性。

1.9 敏感性試驗 將北美H7亞型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA 質粒稀釋至5.3×107Copies/μL，再依次進行10倍倍比稀釋，作為模板進行實時熒光定量RT-PCR擴增，評價該方法的敏感性。

2 結果

2.1 標準曲線的建立 將重組質粒標準品進行10倍倍比稀釋，以6個不同稀釋梯度的標準品質粒作為模板進行熒光定量PCR 擴增，根據DNA 拷貝數和Ct值生成標準曲線。標準曲線中Ct值和標準質粒DNA 濃度間呈現良好的線性關系，相關系數(R2)為0.99，Y=-2.905 log C0+37.406。見中插彩版圖1。

2.2 特異性評價 用建立的實時熒光定量PCR方法對北美H7N2亞型AIV A/New York/107/2003(H7N2) HA質粒，及歐亞分支H7N2、H7N9、H3N2、H5N1、H9N2亞型AIV、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒進行檢測，并設置陰性對照。結果表明，針對北美H7N2禽流感HA質粒出現特異性的擴增曲線，其他病毒及陰性對照均未產生熒光信號，表明該方法有良好的特異性。見中插彩版圖2。

2.3 敏感性評價 以10倍倍比稀釋的北美H7亞型AIV HA 質粒作為模板，評價該方法的敏感性。結果顯示，該引物能檢測出的最低質粒濃度為53 Copies/μL。見中插彩版圖3。

3 討論

自2013年中國發現了全球首例人感染H7N9病例以來，我國每年冬春季都會出現一波人感染H7N9疫情。2017年H7N9病毒進一步發生變異，部分毒株對家禽呈現高致病性，而且2016-2017年的第5波疫情較往年出現更早，報告病例數顯著增多[10]。同時，北美源H7N2、H7N3亞型流感病毒也多次引起人類感染發病，這些均提示我們應加強對該亞型流感病毒的監測。盡管我國自然分離到的H7亞型AIV均屬于歐亞分支，但隨著國際貿易的增加以及候鳥遷徙帶毒的影響，北美源H7亞型AIV傳入我國的風險日益增加，因此建立一種針對北美H7亞型禽流感病毒的快速檢測方法具有重要意義。

本研究中，我們建立了針對北美H7亞型AIV HA基因的SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法。該方法Ct值與DNA濃度間呈現較好的線性關系，可信度高。此外，該方法僅針對北美H7亞型AIV HA 基因出現特異性的擴增曲線，而未檢出歐亞分支H7亞型AIV H7N2和H7N9、其他亞型(H3、H5和H9)流感病毒以及新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒。檢測方法的靈敏度可達53 Copies/μL，具有良好的特異性、敏感性。

SYBR Green I是一種結合于雙鏈DNA 小溝中的熒光染料，其熒光強度的增加與雙鏈DNA 的數量成正比[11]。我們在之前的研究中已經建立了針對北美H7亞型AIV HA基因的RT-PCR檢測方法，該方法適合基層實驗室應用[7]。傳統的RT-PCR檢測方法需要通過核酸電泳進行鑒定，整個過程至少需要3～4 h才能完成。本研究中通過SYBR Green I和引物所建立的實時熒光定量PCR方法，整個過程僅耗時1.5 h，是一種更加簡潔、快速的檢測方法。因此，根據實驗條件與實驗要求的不同，我們所建立的北美H7亞型AIV HA基因檢測方法能夠為監測北美源H7 亞型AIV入境傳播提供準確、有效的工具。