企鵝煙曲霉病的診斷

王玉田，朱華民2，金銀姬，劉 鑫，李志衍,趙 有，潘興亮，劉艷華，鄭瑞峰

(1.北京市畜牧總站，北京朝陽100107 ； 2.北京市房山區琉璃河動物防疫站，北京房山102431，3.北京科為博生物科技有限公司，北京朝陽100850)

2017年2月, 某海洋館已飼養17年的洪氏環企鵝死亡，從2016年8月發現換毛遲緩，逐漸消瘦。 2個星期前發現哮喘，呼吸困難。口服青霉素、鏈霉素等抗生素治療無效，剖檢腹腔、氣囊、肺臟上有1～10 mm黃白色、干酪樣結節。腫瘤、結核或是霉菌不能確定，來我單位診斷，希望確診。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 剖開皮膚，機體消瘦，肺臟、氣囊內有大小不等黃白色結節(見中插彩版圖1、圖2)，無菌采集肺臟上的增生結節組織。

1.2 試驗方法

(1)病理組織血檢驗：增生結節10%福爾馬林固定，經石蠟切片、H.E.染色、抗酸染色、PASM染色顯微鏡鏡檢。

(2)細菌病原檢測：結節組織外部灼燒滅菌, 組織切面涂新鮮血液、巧克力瓊脂培養基、馬鈴薯瓊脂培養基培養；鏡檢，觀察細菌形態，多次分離純化，得到純化細菌(圖3、圖4)。取分離到真菌的DNA作為模板，用真菌菌種鑒定通用引物

(NS1 -GTAGTCATATGCTTGTCTC;NS6-GCAT

CACAGACCTGTTATTGCCTC )進行PCR 擴增，產物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。測序結果提交GenBank，并與其他真菌進行比對，確定18S rDNA 基因型。

2 結果

2.1 病理組織學變化 病理性結節中心干酪性壞死，出現大量浪漢斯巨細胞，具有典型的感染性肉芽腫特征。H.E.染色發現無色透明的絲狀菌絲結構，六胺銀染色(PASM)方法染色可見黑褐色曲霉(圖5)，呈典型的曲霉菌絲特征，菌絲細長有隔，粗細均勻，從結節中心向外周組織放射狀排列(圖6)；抗酸染色未見陽性分支桿菌。

2.2 細菌病原分離、鑒定 經多次分離培養，僅在馬鈴薯瓊脂培養基上菌落生長塊，棉花樣，開始為白色，2～3 d轉為綠色，數日后變為深綠色，呈粉末狀。根據真菌18S rDNA序列差異性分析，確定該菌株18S rDNA 序列(GenBank 登錄號為 KR019681.1)為煙曲霉。

測序獲得的基因序列：

TATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATCCTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTG

TGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATG

CCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAAT

TTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCG

ATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCG

ACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAA

ATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATA

TTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTG

GTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAACCTCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGGGGAACCAGGACTTTTACTGTGA

AAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCT

ATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTG