油菜莖基潰瘍病菌LAMP-HNB檢測方法的建立

龍 陽，馬新華，袁俊杰，盧乃會，楊卓瑜，魏 霜，王衛芳

（1.湛江出入境檢驗檢疫局，廣東 湛江 524042；2.廣東出入境檢驗檢疫局，廣東 廣州 510623）

油菜莖基潰瘍病菌是油菜上最嚴重的真菌病害之一，是我國重要的檢疫性有害生物［1］。近年來，湛江口岸多次從進境油菜籽樣品中截獲該病菌。油菜莖基潰瘍病菌正嚴重威脅著我國油菜產業的生產安全，高效快速檢測技術成為預防油菜莖基潰瘍病傳入我國的關鍵措施之一。目前油菜莖基潰瘍病菌常用檢測方法主要有分離培養法、聚合酶鏈式反應（PCR）檢測法以及發病癥狀觀察法［2-4］。其中，分離培養法培養時間長，工作量大，如果完全通過分離培養來完成對病害的檢疫鑒定，針對性差，費時費力，與快速通關的需求不符；PCR檢測法具有快速、準確、重復性好的優點，但是其對檢測設備和檢測人員要求較高，難以適用于多種檢測環境；發病癥狀觀察法由于某些病原引起的癥狀相似，較難準確判定。本研究采用的環介導等溫擴增技術區別于傳統的PCR法［5］，其不需要昂貴的PCR儀器，且特異性強、靈敏高、操作簡單、擴增反應時間較短，比較容易在基層實驗室推廣使用等優點，目前已廣泛應用于各類植物病原菌的檢測工作中。張裕君等［6］應用該技術成功檢測了苜蓿疫霉根腐病菌，Tomlinson等［7］等建立了灰霉病菌的LAMP檢測方法，Niessen等［8］運用LAMP技術檢測出了禾谷鐮刀菌，田擎等［9］檢測了黑白輪枝菌，戎振洋等［10］以TAT基因為靶標設計了一套用于檢測水稻中Fusarium andiyazi的LAMP檢測方法。雖然LAMP技術存在諸多優點，但也存在易污染、假陽性等缺陷［11］。

本研究通過在建立的油菜莖基潰瘍病菌LAMP檢測反應體系中添加羥基萘酚藍（hydroxy naphthol blue，HNB）反應指示劑［12］，反應完成后可以以通過肉眼直接對結果進行判定，無需再開蓋檢測，可以有效避免氣溶膠污染，預防LAMP檢測過程中常見的假陽性問題，一定程度上克服了LAMP技術易污染的缺點，對預防油菜莖基潰瘍病傳入我國具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油菜莖基潰瘍病菌L. maculans陽性DNA來源于《CNCA-15-A03油菜莖基潰瘍病菌檢測》能力驗證陽性樣品。 燕麥細鐮刀菌Fusarium avenaceum、鏈格孢屬Alternariasp.、莖點霉屬Phomasp.、核盤菌Sclerotinia sclerotiorum；油菜黑脛病菌L.biglobosa分離于進口加拿大油菜籽。取10批油菜籽樣品，按照《GB/T31793-2015油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》中4.1的要求對其進行前處理。

植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03，購自TIANGEN公司； DL2000 Premix DNA Marker購自Takara公司；Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶購自New England Biolabs公司;羥基萘酚藍（HNB）購自Sigma公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 按照植物基因組DNA提取試劑盒DP305-03的要求對1.1中樣品進行基因組DNA提取。

1.2.2 引物設計 參考LAMP引物設計方法和要求［1］，根據油菜莖基潰瘍病菌ITS保守序列設計LAMP引物1套（表1）。常規PCR引物參照《GB/T 31793-2015油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》4.5.2常規PCR方法一中的引物，產物大小為 279 bp［13］。

表1 油菜莖基潰瘍病菌LAMP檢測引物序列

1.2.3 LAMP-HNB反應體系的建立及優化 對LAMP反應體系中的Mg2+濃度（1～6 mmol/L）、dNTPs濃度（0.2～2 mmol/L）、F3/B3引物濃度（0.1～0.5 μmol/L）、FIP/BIP引物濃度（0.4～2.0 μmol/L）、HNB 濃度（50～250 μmol/L）、Bst DNA聚合酶濃度（0.08～0.64 U/μL），反應溫度（60～70℃）及反應時間（30～90 min）進行優化。

1.2.4 LAMP-HNB特異性評價 按照1.2.3中LAMP反應體系，以1.2.1中提取的5個樣品基因組DNA為模板，以油菜莖基潰瘍病菌基因組DNA為模板做陽性對照，以水為模板做陰性對照，對所建立的LAMP-HNB反應體系的特異性進行評價。

1.2.5 LAMP-HNB靈敏度評價 以1.2.1的方法提取油菜莖基潰瘍病菌基因組DNA，用核酸蛋白分析儀標定濃度為100 ng/μL，再按10倍梯度稀釋為 10 、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL的模板濃度，共6個模板濃度，分別取2 μL作為模板按照1.2.3的方法進行靈敏度實驗。

1.2.6 LAMP-HNB體系對實際樣品的檢測 利用LAMP-HNB體系對10批油菜籽樣品進行檢測，將得到的結果與常規PCR檢測結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 LAMP-HNB檢測方法建立

通過調整優化LAMP反應體系，確定最終反應體系為10×等溫擴增反應緩沖液2.5 μL，Mg2+4.0 mmol/L，dNTP Mix 1.0 mmol/L，F3、B3引物終濃度0.2 μmol/L，FIB、BIP引物終濃度1.6 μmol/L， HNB150 μmol/L，Bst2.0 WarmStart DNA聚合酶0.16 U/μL，DNA模板2.0μL，ddH2O調節最終體積至25μL。反應條件為62℃ 80 min。結果見圖1（彩插二），陽性樣品顯示為天藍色，陰性對照未反應為淺藍色；LAMP反應產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證，陽性樣品有典型的LAMP反應條帶，陰性對照無反應條帶，與顯色反應一致。

2.2 LAMP-HNB特異性評價

如圖2（彩插二）所示，僅油菜莖基潰瘍病菌陽性DNA發生擴增反應變為天藍色，其他5種油菜籽中常見的菌株均未發生擴增反應，呈淺藍色。表明所建立的LAMP-HNB檢測方法特異性強。

2.3 LAMP-HNB靈敏度評價

如圖3（彩插二）所示，當DNA模板量在0.01 ng/μL以上時，LAMP-HNB均能發生擴增反應而顯色，而常規PCR檢測在0.1 ng/μL時結果已經較為微弱，低于0.1 ng/μL時已經無法獲得陽性結果，LAMP-HNB方法的靈敏度是常規PCR的10倍。

2.4 LAMP-HNB對實際樣品檢測結果

如圖4（彩插二）所示，利用LAMP-HNB及常規PCR對10批油菜籽樣品進行檢測，檢出5批陽性樣品，兩者檢測結果一致。

3 討論

LAMP方法是一種靈敏度極高的檢測方法，其靈敏度一般可達到普通PCR的10倍以上，因此如果采用常規的瓊脂糖凝膠電泳對其產物進行判定，極易產生氣溶膠污染，導致檢測結果假陽性。為避免污染的產生，閉管檢測并直接進行結果判定的方法被廣泛研究，目前閉管判定常用的方法有目視濁度法、濁度儀檢測法、染料顯色法等三大類，由于LAMP反應中會產生大量的焦磷酸根離子，其能與反應體系中的鎂離子結合生成焦磷酸鎂白色沉淀，這為肉眼判定結果提供可能，但是當濁度較低時，肉眼難以準確判定；濁度儀檢測法主要依靠專用設備實時對反應體系中的渾濁度進行檢測，但是其需要專用設備，不利于現場快速檢測；染料顯色法是目前LAMP閉管檢測研究應用的重點方向，其中鈣黃綠素顯色法會降低反應靈敏度，SYBR Green染料顯色需經特殊處理或反應后開蓋加入，各有弊端［11，13-14］。本研究采用的羥基萘酚藍顯色法不需額外添加任何成分，對反應體系影響較小，現已被廣泛應用，但需注意的是，陰性反應顯色結果與反應體系中是否存在甜菜堿相關，當存在時，呈紫羅蘭色，當不存在時，則呈淺藍色［6，10，12］。

油菜莖基潰瘍病是油菜上最嚴重的真菌病害之一，其致病力強，造成損失大，據估計，全世界因此病而造成油菜經濟損失超過3億歐元［15］。該病原菌廣泛分布于亞洲、非洲、美洲、歐洲及大洋洲等地，但在我國還未見報道。該病菌能通過植株、種子等進行遠距離傳播，我國是油菜種植大國，且各方面條件都適宜該病菌繁衍，因此一旦該病菌傳入我國并定殖，可能會對我國相關產業造成毀滅性破壞。本研究建立的油菜莖基潰瘍病菌LAMP-HNB檢測方法，具有特異性強、適用范圍廣的優點，適用該病菌的快速篩檢，運用該方法對實際樣品進行檢測，結果與GB/T 31793-2015中PCR方法檢測結果一致，且耗時更短，對油菜莖基潰瘍病菌的快速篩查具有較強的實用價值。

［1］ 孫穎，周國梁，Malgorzata J，等. 油菜莖基潰瘍病菌在中國定殖的可能性評估［J］. 植物保護學報，2015，42（4）：523-530.

［2］ 王振華，楊武，趙暉，等. 加拿大進境油菜籽莖基潰瘍病菌的檢測與鑒定［J］. 華中農業大學學報，2011，30（1）：66-69.

［3］ 周國梁，尚琳琳，于翠，等. 進境油菜籽中黑脛病菌和莖基潰瘍病菌的檢測［J］. 植物保護學報，2010，37（4）：289-294.

［4］ 王振華，趙暉，宋祺，等. 加拿大進境油菜籽加工過程中油菜莖基潰瘍病菌的檢測與鑒定［J］. 植物檢疫，2010，24（6）：25-26.

［5］ Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic Acids Research，2000，28（12）：1-7.

［6］ 張裕君，劉躍庭，廖芳，等. 基于LAMP 方法的苜蓿疫霉根腐病菌分子檢測研究［J］.中國植保導刊，2011，31（10）：7-9.

［7］ Tomlinson J A，Dickinson M J，Boonham N.Detection ofBotrytis cinereaby loop-mediated isothermal amplification［J］. Letters in Applied Microbiology. 2010，51：650- 657.

［8］ Niessen L，Vogel R F. Detection of Fusarium graminearum DNA using a loop-mediated isothermal amplification（LAMP）assay［J］. Int.J. Food Microb，2010，140：183-191.

［9］ 田擎，曾丹丹，李彬，等. 利用環介導等溫擴增技術檢測黑白輪枝菌［J］. 南京農業大學學報，2016，39（4）：582-588.

［10］ 戎振洋，袁詠天，曾丹丹，等. 基于環介導等溫擴增技術快速診斷由Fusarium andiyazi引起的水稻惡苗病［J/OL］. 植物病理學報：1-11（2017-08-24）.

［11］ 黃火清，郁昂. 環介導等溫擴增技術的研究進展［J］. 生物技術，2012，22（3）：90-94.

［12］ Goto M，Honda E，Ogura A，等. Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue［J］. BioTechniques，2009，46（3）：167-172 .

［13］ 初亞男，封利穎，張婕妤，等. 環介導等溫擴增技術改進的研究進展［J］. 微生物學通報，2015，42（4）：729-735.

［14］ 胡宗悅，須周恒，盧亦愚. 環介導等溫擴增技術的常見問題分析與研究進展［J］. 病毒學報，2016，32（5）：659-665.

［15］ Fitt B D L，Hu B C，LI Z Q，et al. Strategies to prevent spread ofLeptosphaeria maculans（phoma stemcanker）onto oilseed rape crops in China;costs and benefits［J］. Plantpathology，2008，57（4）：652-664.