低溫連續相變萃取油茶籽粕中抑菌物質及其抑菌活性研究

丘苑新，趙 麗，曹 庸，柳建良

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

國內外對植物中功能性活性物質的提取方法有傳統的水提和醇提法，也有亞臨界流體提取和超臨界CO2提取法等先進的提取方法，前者提取的成分比較復雜、得率低、對所提取成分的破壞性大，后者用低溫提取，所得成分活性強、提取率高，但條件要求高、產能低、生產成本高、難以實現工業化大生產。低溫連續相變萃取是以亞臨界狀態的流體或亞臨界流體的混合溶液為溶媒，與溶質在系統內相繼經過浸提、蒸發分離、濃縮、冷凝回收等過程，從天然產物中提取目標組分的一種新技術。當液化石油氣、丙烷、丁烷、異丁烷、甲醚、四氟乙烷和六氟化硫等以亞臨界流體狀態存在時，分子的擴散性能增強，傳質速度加快，對天然產物中弱極性以及非極性物質的滲透性和溶解能力顯著提高。亞臨界環境下萃取，不破壞熱敏性成分、目的物完全，被視為綠色環保、前景廣闊的一項變革性技術［1］。本研究采用低溫連續相變的提取方法對油茶籽粕中的抑菌物質進行提取［2］，以不同濃度的乙醇作為夾帶劑，以一定流速流經萃取釜萃取茶油進入解析釜中，在解析釜中通過加熱、減壓使萃取劑相變為氣態，再通過即時冷卻降溫，萃取劑相變為液態回流至溶劑桶中，再通過壓力泵壓縮至萃取釜中萃取物質，如此不斷循環獲得提取物。此法提取目標性強、得率高，并可連續生產，具有很大的應用前景［3］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試油茶籽粕由廣東瑞豐農科有限公司提供，將榨油后的油茶粕烘干粉碎，過孔徑0.075 mm篩［4］，備用；供試菌種包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉，由華南農業大學食品學院微生物實驗室保藏，均為廣東省微生物所提供。

試劑包括95%乙醇、蘆丁（標準品，純度98%）、亞硝酸鈉、硝酸鈉、香草醛、微生物培養基，均購于廣州君燁試劑有限公司。儀器設備包括連續相變萃取設備（華南農業大學食品學院自行設計制造）、R201BL型旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）、TDL-5型臺式離心機（上海安亭科技儀器廠）、FW100型高速萬能粉碎機（天津市華鑫儀器廠）、FD-1型冷凍干燥機（北京博醫康技術公司）、U-3010紫外可見分光光度計（日本日立公司）、XW-80A漩渦混合器（上海精科實業有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗 （1）稱取油茶籽粕1.5 kg，固定萃取壓力0.4 MPa、萃取溫度80℃、萃取時間2 h，設萃取劑乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%。提取液減壓濃縮后凍干，用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌實驗［5］。（2）稱取油茶籽粕 1.5 kg，固定乙醇濃度為80%、萃取時間2 h、萃取溫度80℃，設萃取壓力為 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 MPa。提取液減壓濃縮后凍干，用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌實驗。（3）稱取油茶籽粕1.5 kg，固定乙醇濃度為80%、萃取壓力0.4 MPa、萃取時間2 h，設萃取溫度為50、60、70、80、90℃。提取液減壓濃縮后凍干，用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌實驗。（4）稱取油茶籽粕1.5 kg，固定乙醇濃度為80%、萃取壓力0.4 MPa、萃取溫度80℃，設萃取時間為1、2、3、4、5 h。提取液減壓濃縮后凍干，用于對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌實驗。

1.2.2 正交實驗 根據單因素試驗所得的最優實驗條件，設計L9（34）正交實驗，具體見表1，研究不同乙醇濃度、萃取時間、萃取溫度、萃取壓力等因素下所得提取物的含量，并根據極差直觀分析，得出最佳萃取工藝條件。

表1 低溫連續相變提取抑菌物質L9（34）正交實驗因素水平

1.2.3 抑菌活性檢測方法 細菌抑菌實驗：選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為供試菌，測定抑菌圈直徑大小；霉菌抑菌實驗：選取黑曲霉作為供試菌，測定抑菌圈直徑大小［6-8］。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇濃度對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響 由圖1可知，隨著乙醇濃度的逐漸升高，油茶籽粕粗提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌活性均有增大的趨勢，其中以80%乙醇提取物抑菌圈最大，說明其抑菌活性最強。因此，在正交實驗設計中，以80%乙醇設為中心點，由此也可見，提取介質的極性對提取物的抑菌活性是有影響的，這與很多研究結果［9］相一致，80%乙醇能提取到抑菌活性較強的抑菌物質，可能是大部分抑菌活性物質的極性與80%濃度乙醇的極性相當。

圖1 不同濃度乙醇對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響

2.1.2 萃取壓力對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響 圖2顯示，隨著系統萃取壓力的逐漸升高，抑菌活性有所變化，但規律不明顯，當萃取壓力達到0.5 MPa后，提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌效果保持在較高水平。因此，選取壓力為0.5 MPa用于正交實驗設計，過低的壓力不利于提取介質的流動，過高的壓力不利于抑菌活性物的溶出［10］。

圖2 不同萃取壓力對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響

2.1.3 萃取溫度對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響 由圖3可知，隨著萃取溫度的逐漸升高，提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉的抑菌活性都有增大的趨勢，當萃取溫度超過80℃后，抑菌活性呈現逐步下降的趨勢。這可能是因為在一定溫度范圍內，溫度的升高有利于物料中抑菌活性物的滲出，但過高的溫度會損傷抑菌物的活性［11］。因此，選取80℃為低溫連續相變萃取油茶籽粕的提取溫度。

圖3 不同萃取溫度對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響

圖4 不同萃取時間對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響

2.1.4 萃取時間對油茶籽粕提取物抑菌活性的影響 從圖4可以看出，隨著萃取時間的逐漸延長，提取物對3種菌的抑菌圈變化不明顯，在提取2 h時提取物抑菌圈較大，當萃取時間超過2 h以后抑菌圈的直徑沒有明顯增大，即提取時間對抑菌活性的影響不顯著，延長提取時間與提取物得率關系不大。因此，選取2 h為正交實驗的提取時間。

2.2 正交實驗結果

為考察各因素間的交叉影響，在以上單因素試驗的基礎上，以提取物的抑菌活性為考察指標，以乙醇濃度（A）、萃取時間（B）、萃取壓力（C）、萃取溫度（D）為因素，設計L9（34）正交實驗研究連續相變萃取對活性物質提取的分離效果，研究以上4個因素與提取物抑菌能力之間的關系，并根據極差分析、直觀分析優化最佳提取工藝條件。從正交實驗結果（表2）可以看出，提取物對大腸桿菌具有最強抑菌活性的提取工藝條件是A2B1C2D1，對金黃色葡萄球菌和黑黃霉具有最強抑菌活性的提取工藝條件均為A2B3C1D2。可見，乙醇濃度對油茶籽粕提取抑菌活性物的影響比較大、也比較確定的都是80%濃度的乙醇，其他3個因素對抑菌效果的影響因指標不同而有所變化，對金黃色葡萄球菌與黑曲霉的抑制作用，具有最強抑菌效果的提取工藝參數相同。

從因素指標分析可知，乙醇濃度和萃取溫度對3種菌的抑菌活性影響最大，抑菌活性達最大時乙醇濃度均為80%、萃取溫度均為80℃，提取物同時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉3種菌具有較高抑菌活性的萃取壓力水平是0.4 MPa。對于因素萃取時間（B）的水平選擇，參考單因素試驗，萃取時間對抑菌物抑菌活性的影響不大，推測是由于受高溫影響，太長的萃取時間對抑菌活性物有一定的破壞作用，因此萃取時間選取1 h進行驗證。

因此，在本研究的試驗條件下，各因素最優水平分別為萃取介質是80%乙醇、萃取時間為1 h、萃取壓力為0.4 MPa、萃取溫度為80℃。對以上因素水平進行實驗驗證，其提取物凍干后對大腸桿菌的抑菌圈直徑為13.6 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.1 mm，對黒曲霉的抑菌圈直徑為13.8 mm，達到最好的抑菌效果。

3 結論與討論

低溫連續相變萃取技術可選擇的溶劑極性范圍廣、提取針對性強、得率高，且可同時配置多個萃取釜以實現連續性生產；分離提取和濃縮一并完成，可節省能源；提取裝置構造簡單，對材料要求不高，是一種可實現工業化大生產的極為有效的提取技術。連續相變萃取技術適用于大部分天然產物的萃取，若加以改進，還可形成兩條萃取回路，整個萃取過程中，萃取劑的相變過程是即時的、連續的，且萃取劑循環使用，溶劑使用量少，可減少對環境的污染。同時，采用低溫連續相變萃取可以針對提取物的極性來調整提取介質的極性，且條件溫和、易于操控、危險性小［12］。本研究所選用的乙醇及水混合液在真空狀態下，60℃左右的溫度可以實現相變，是一種極好的極性提取介質。采用低溫連續相變萃取方法以乙醇作為提取介質，可以提取出油茶籽粕中具有抑菌活性的物質。本研究得到最優的油茶籽粕活性物連續相變提取的工藝條件為：乙醇濃度80%、萃取時間1 h、萃取壓力0.4 MPa、萃取溫度80℃。在此條件下其提取物凍干后對大腸桿菌的抑菌圈直徑為13.6 mm、對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為15.1 mm、對黑曲霉的抑菌圈直徑為13.8 mm，達到最好的抑菌效果。

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