乳化植物油強化土著微生物修復中高濃度Cr(Ⅵ)污染地下水

董 軍，徐 暖，劉同喆，管 銳，鄧俊巍

吉林大學環境與資源學院/地下水資源與環境教育部重點實驗室，長春 130021

0 引言

鉻是一種具有氧化還原活性的重金屬，主要以Cr(Ⅲ) 和Cr(Ⅵ)兩種形式存在于環境中，其中Cr(Ⅵ)具有毒害性強、易遷移、致癌、致突變性等特性，被許多國家列為“優先污染物”[1]。目前，由于工業生產過程中產生的含Cr(Ⅵ)廢水和廢渣處置不當，造成局部地區地下水Cr(Ⅵ)污染嚴重[2]；因此，對Cr(Ⅵ)污染的地下水進行修復已迫在眉睫。原位生物修復作為一種低成本、易管理的修復方法備受青睞。其原理是通過外加營養物質，刺激強化土著微生物 (鉻還原菌、鐵還原菌等) 直接或間接地將低質量濃度(低于10 mg/L)的Cr(Ⅵ) 還原為Cr(Ⅲ) ，前人[3-4]對此已有研究。但在實際場地應用中，國內報道的鉻渣堆存場地地下水Cr(Ⅵ)質量濃度高達107.2 mg/L[5-6]。王鳳花等[7]研究表明，Cr(Ⅵ)能與微生物體內的大分子物質相結合，影響微生物的新陳代謝，且Cr(Ⅵ)質量濃度越高，抑制作用越強[8]。然而，利用原位生物技術修復中、高質量濃度Cr(Ⅵ)污染是否可行，尚未見報道。另外，從添加營養物質角度來看，已有研究[9]表明，乳化植物油在地下環境中遷移性良好，且能長期提供碳源和電子供體，在原位強化生物化學修復地下水中氯化溶劑類有機物有很好的效果。本文擬采用乳化植物油作為外加碳源，對中、高濃度Cr(Ⅵ)污染地下水進行修復，并對產物穩定性和環境影響進行評估。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

乳化植物油：將大豆油、Tween80、蒸餾水按比例混合，利用高速多用分散機 (沃的 GF1100) 攪拌30 min，制得50.0 g/L的乳白色的水包油型乳液，靜置24 h無分層破乳，備用。K2Cr2O7、酵母浸粉均為分析純，來自北京化學試劑廠。實驗用細砂為吉林省伊通河的天然河砂，經篩分后使用，其pH為6.80，粒徑為0.10～0.25 mm，有機質質量分數為1.7%，總鐵質量分數為8.34 mg/g，總鉻為0 mg/g。

1.2 實驗操作

在一系列50.0 mL頂空瓶中分別加入25.0 g細砂和25.0 mL反應液，其中反應液由50 g/L乳化植物油、酵母浸粉、200.0 mg/L的重鉻酸鉀溶液和蒸餾水配制；配制后各體系的乳化植物油質量濃度為5.0 g/L，酵母浸粉質量濃度為0.20 g/L，重鉻酸鉀質量濃度分別為0.0、20.0、30.0、50.0、80.0、110.0 mg/L。另外設置Cr(Ⅵ)質量濃度為20 mg/L的不添加乳化植物油和滅菌對照組。頂空瓶密閉，混合搖勻，然后置于20 ℃暗光恒溫培養箱中培養。每個梯度處理重復13瓶，定期取新反應瓶，測定上部液體pH和溶解氧 (dissolved oxygen，DO)、Fe(Ⅲ)、總鐵 (total iron，TFe)、Cr(Ⅵ)、總鉻 (total chromium，TCr) 和總有機碳 (total organic carbon，TOC) 的質量濃度。反應結束后，采用Tessier連續提取法[10]分析介質表面鉻的存在形態。

1.3 測定方法

DO質量濃度使用美國哈希公司Hach Sension+ DO6溶解氧儀測定；pH使用美國YSI公司便攜式YSI pH100型pH計測定。水樣經0.45 μm水系濾膜過濾后，采用火焰原子吸收分光光度法 (HJ 757-2015) 測定TCr質量濃度；采用二苯碳酰二肼分光光度法 (GB 7467-87) 測定Cr(Ⅵ)質量濃度；采用硫氰酸鹽分光光度法(DZ/T 0064.24-93)測定Fe(Ⅲ)和TFe質量濃度，TFe與Fe(Ⅲ)的濃度差值為Fe(Ⅱ)質量濃度；采用重鉻酸鉀氧化分光光度法 (HJ 615-2011) 測定TOC質量濃度。

2 結果與討論

2.1 Cr (Ⅵ) 的還原

圖1a為ρ(Cr(Ⅵ))隨時間(t)的變化，由其可見，各反應體系中ρ(Cr(Ⅵ))均有明顯下降，反應77 d后，各體系ρ(Cr(Ⅵ))分別從初始的20.0、30.0、50.0、80.0、110.0 mg/L下降到0.0、5.8、19.0、43.6、65.8 mg/L，去除率分別為100.0%、80.7%、61.9%、45.5%、40.2%。其中：20 mg/L的體系在反應的第42天ρ(Cr(Ⅵ))降到0.25 mg/L；第56 天時，該體系檢測出Fe(Ⅱ)，累積ρ(Fe(Ⅱ))為4.6 mg/L，說明Cr(Ⅵ)得到了有效的還原。圖1b的ρ(TCr) 變化趨勢與圖1a的ρ(Cr(Ⅵ))的變化趨勢相一致，說明Cr(Ⅵ)得到了有效還原并沉淀進入介質中[11]。如圖1c所示：未添加乳化油和滅菌對照組中ρ(Cr(Ⅵ))在實驗初期稍有降低，之后基本保持穩定；77 d時Cr(Ⅵ)去除率分別為7.3%和7.0%，說明實驗組ρ(Cr(Ⅵ))的降低主要是由于乳化油植物油作為碳源和電子供體刺激強化土著微生物還原Cr(Ⅵ)的結果。各體系的ρ(Cr(Ⅵ))在實驗初期均有一定的下降，首先主要可能是由于介質中的膠體物質和團粒結構對Cr(Ⅵ)的吸附和包被作用[12]；其次，介質中的Fe(Ⅱ)等還原性組分的還原作用也能使ρ(Cr(Ⅵ)) 降低。隨著實驗繼續進行，微生物適應了環境體系，生物還原作用成為ρ(Cr(Ⅵ))持續降低的主要動力。迄今為止，已有許多種具有鉻還原作用的微生物被證實，包括地桿菌屬、希瓦氏菌屬、地弧菌屬、地發菌屬、脫硫單孢菌屬等[13]，各種微生物對于Cr(Ⅵ)脅迫的響應不同[12,14]。 陳子方[15]以工業糖漿作為碳源生物修復Cr(Ⅵ)污染地下水研究中，對修復過程中微生物群落的分析表明，豐度總和超過50%的微生物具有Cr(Ⅵ)還原能力，以鉻還原菌和異化鐵還原菌為主。本研究中的功能微生物種群及其演化規律還有待進一步研究。此外，隨著ρ(Cr(Ⅵ))的升高，各體系ρ(Cr(Ⅵ)) 下降的數值是逐漸增加的，可能是由于初始ρ(Cr(Ⅵ)) 不同，導致馴化的具有還原作用微生物種類、數量不同。

圖1 鉻質量濃度隨時間變化Fig.1 Variation of the concentration of Cr over time

2.2 地下環境的變化

2.2.1 鐵質量濃度變化

由圖2可見，未添加Cr(Ⅵ)的反應體系，反應15 d時檢出ρ(Fe(Ⅱ))為17.9 mg/L；之后快速累積，42 d時ρ(Fe (Ⅱ))達到117.0 mg/L，表明異化鐵還原微生物可以快速生長，Fe(Ⅲ)異化還原為Fe(Ⅱ)。但當Fe(Ⅱ)濃度過高時，會抑制鐵還原微生物的生長生存[16]，而導致42 d以后ρ(Fe(Ⅱ))不斷降低；同時，體系中的Fe(Ⅱ)發生了礦化作用，形成了藍鐵礦、菱鐵礦等礦物，細砂的顏色也從最初的黃色變為灰黑色，Thomas等[17]的研究也出現了此現象。這些新形成的二價鐵礦物具有較大的比表面積，并含有Fe(Ⅱ)和羥基組成的表面官能團，具有較強的還原、吸附能力，可有效防止Cr(Ⅵ)污染羽擴散。

初始ρ(Cr(Ⅵ))為20.0 mg/L的體系，在Cr(Ⅵ)被完全還原后，反應56 d時檢測出Fe (Ⅱ)，其滯后于液相中ρ(Cr(Ⅵ))降低到0.0的時間點(圖1a) 。這可能是由于介質中吸附的Cr(Ⅵ)的解吸，即當Cr(Ⅵ)被完全還原之后，體系中才會有Fe(Ⅱ)的積累[17]。實驗初始時，產生的Fe(Ⅱ) 均與Cr(Ⅵ)發生反應，因此未見積累，當ρ(Cr(Ⅵ))降低之后，Fe(Ⅱ)才開始積累。ρ(Fe(Ⅱ))從56 d到77 d的快速積累表明，Cr(Ⅵ)被完全還原后，異化鐵還原作用仍在持續進行，同時也說明乳化植物油緩慢釋放碳源和電子供體的性能。

圖2 二價鐵質量濃度隨時間變化Fig.2 Variation of the concentration of Fe(Ⅱ) over time

2.2.2 pH變化

由圖3可以看出：各反應體系中的pH均呈下降趨勢，而且ρ(Cr(Ⅵ))初始濃度越低，pH下降越明顯；77 d時，各體系pH分別從初始的7.71、7.57、7.35、7.35、7.13、6.89下降到6.23、5.81、6.69、6.69、6.41、6.46。反應體系中pH的變化，首先可能是由于乳化植物油中的長鏈脂肪酸，如棕櫚酸(C16H32O2)、油酸(C18H34O2)、亞油酸 (C18H32O2)、亞麻油酸 (C18H30O2) 等經過β氧化，產生乙酸等小分子有機酸，使pH降低[18]；其次，微生物異化鐵還原作用生成OH-，使pH升高[19]，Fe(Ⅱ)還原Cr(VI)并沉淀伴隨生成H+，使pH降低[20]；再次，碳源代謝的終產物CO2溶于水，形成CO32-和HCO3-，引起pH降低；最后，重鉻酸鉀在溶液中發生水解反應[21]

產生H+，也可使pH降低。pH的降低促進了Fe (Ⅲ)的溶出，有助于促進異化鐵還原作用的進行[22]。

圖3 pH隨時間變化Fig.3 Variation of the value of pH over time

結合圖2和圖3，初始ρ(Cr(Ⅵ))為0.0和20.0 mg/L的反應體系，其Fe(Ⅱ)快速積累階段，反應體系的pH均有明顯的下降，這主要是由于異化鐵還原作用使反應體系變成了水解酸化微生物，更適宜生存的厭氧環境，水解酸化的增強使得體系pH下降。而ρ(Fe (Ⅱ))過高，抑制了異化鐵還原過程，體系pH過低也使得水解酸化作用減弱，此時體系中的產甲烷菌利用CH3COOH、H2、CO2形成甲烷，使得初始ρ(Cr(Ⅵ))為0.0的反應體系后期pH升高。

綜上所述，各反應體系中的生物、化學等作用是體系中pH變化的主要動力。總體來看，pH處在中性或偏酸性范圍，且地下環境介質具有一定的酸緩沖能力，因此，一般情況下不會對地下環境中重金屬的存在狀態產生顯著影響。

2.2.3 DO質量濃度變化

從圖4可以看出，ρ(DO)隨時間不斷下降。初始ρ(Cr(Ⅵ))對ρ(DO)的變化影響并不明顯。反應77 d時，各體系的ρ(DO)均降至0.0～1.5 mg/L，形成了兼性厭氧環境。反應初期兼性細菌在產酸的過程中消耗了體系中的氧氣并生成小分子有機酸，從而使ρ(DO)和pH都降低。初始ρ(Cr(Ⅵ))為0.0的體系，微生物的生長沒有受到抑制，體系中的氧消耗速度更快，更易形成厭氧環境；而添加Cr(Ⅵ)的體系，ρ(DO)的下降速率相對較慢，可能是由于ρ(Cr(Ⅵ))較高，對耗氧微生物有一定的抑制作用。

圖4 溶解氧質量濃度隨時間變化Fig.4 Variation of the concentration of DO over time

2.2.4 TOC質量濃度變化

從各反應體系中ρ(TOC)隨時間變化圖(圖5)可知：1)初始添加5.0 g/L的乳化植物油后，反應體系的ρ(TOC) 為9 891.0 mg/L；在第1 天時，各反應體系液相中ρ(TOC)均低于2 200.0 mg/L，出現了大幅下降。其主要原因是，細砂能夠吸附大量的乳化植物油[23]；此外，Ca2+、Fe2+可以和其中的油酸等成分形成沉淀[24]，也導致了液相體系中ρ(TOC)的降低。2)7 d以后，ρ(TOC)基本趨于穩定降低，說明體系進入穩定的反應階段。初始ρ(Cr(Ⅵ))為0.0的體系，ρ(TOC)在中后期偏低，主要是由于體系微生物不受抑制的大量生長，消耗了大量的有機物。3)實驗進行77 d后，體系中除了被大量吸附的乳化植物油，液相中的ρ(TOC)仍然超過600.0 mg/L，說明乳化植物油在地下環境中可以長期提供碳源和電子供體，以便微生物生長和降解污染物，這與Robert等[25]的研究是一致的。

圖5 TOC質量濃度隨時間變化Fig.5 Variation of the concentration of TOC over time

2.3 還原產物的穩定性

如圖6，用Tessier連續提取法對反應后介質樣品中Cr的存在形態進行分析，發現其主要以鐵錳結合態和有機結合態的形式存在，其他形態的Cr并未檢出，這與生賀[26]的研究結果基本一致。鐵錳結合態和有機結合態的Cr均能夠在自然環境下穩定存在，其再次釋放進入環境的風險大大降低[27]。通常情況下，在pH=6～8時，Cr(Ⅵ)和Cr(Ⅲ)轉化的氧化還原電位為420～840 mV，在加入乳化植物油等碳源后，地下環境的ORP(氧化還原電位)會迅速降低，通常為缺氧或者厭氧的還原環境，遠低于420 mV，為Cr(Ⅵ)還原產物的穩定存在創造良好條件。

圖6 細砂中鉻存在形態Fig.6 Existing forms of Cr in the sand

3 結論

1) 乳化植物油能作為長效緩釋碳源強化土著微生物原位修復質量濃度高達110.0 mg/L的Cr(Ⅵ)污染地下水，還原產物主要以能夠在自然環境中穩定存在的鐵錳結合態和有機結合態等形式存在。

2) 原位生物修復過程對地下環境的影響較小。外加乳化植物油強化土著微生物修復Cr(Ⅵ)污染的過程中，地下水的DO質量濃度會顯著降低，形成還原環境；各種生化反應過程導致的pH變化范圍較小，不會對地下環境重金屬類的存在產生影響。

[1] 楊維，王立東，徐麗，等. 鉻污染地下水的PRB反應介質篩選及修復實驗[J]. 吉林大學學報 (地球科學版) ，2008，38 (5):854-858.

Yang Wei, Wang Lidong, Xu Li, et al. Experiment on Selection of PRB Media and Remediation of Chromium Contaminated Groundwater [J]. Journal of Jilin University (Earth Science Edition) , 2008, 38 (5): 854-858.

[2] 劉海龍，馬小龍，袁欣，等. 基于多元回歸分析的鉻污染地下水風險評價方法[J]. 吉林大學學報 (地球科學版)，2016，46 (6):1823-1829.

Liu Hailong, Ma Xiaolong, Yuan Xin, et al. Risk Assessment Method of Chromium (Ⅵ) Polluting Groundwater Based on Multiple Regression Analysis [J]. Journal of Jilin University (Earth Science Edition), 2016, 46 (6): 1823-1829.

[3] Francis C A, Obraztsova A Y, Tebo B M. Dissi-milatory Metal Reduction by the Facultative Anaerobe Pantoea Agglomerans SP1 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66 (2):543-548.

[4] Tebo B M, Obraztsova A Y. Sulfate-Reducing Bac-terium Grows with Cr(Ⅵ) , U(Ⅵ) , Mn (Ⅳ) and Fe(Ⅱ) as Electron Acceptors [J]. Fems Microbiology Letters, 2006,162 (1):193-198.

[5] 孟凡生. 中國鉻渣污染場地土壤污染特征[J]. 環境污染與防治，2016，38 (6)：50-53.

Meng Fansheng. Pollution Characteristics of Soils Polluted by Chromium Slag in China [J]. Environmental Pollution and Control, 2016, 38 (6): 50-53.

[6] 張森琦，王建榮，李其江，等. 青海海晏海北化工廠地下水Cr(Ⅵ)污染機理及治理方案[J]. 現代地質，2009，23 (1):94-102.

Zhang Senqi, Wang Jianrong, Li Qijiang, et al. Cr (Ⅵ)-Pollution Mechanism and Control Method of Groundwater in Haibei Chemical Plant of Haiyan County, Qinghai Province [J]. Geoscience, 2009, 23 (1): 94-102.

[7] 王鳳花，羅小三，林愛軍，等.土壤鉻 (Ⅵ) 污染及微生物修復研究進展[J]. 生態毒理學報，2010，5 (2):153-161.

Wang Fenghua, Luo Xiaosan, Lin Aijun, et al. Process on Microbial Remediation of Chromium-Contaminated Soil [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5 (2): 153-161.

[8] 黃順紅，楊志輝，柴立元，等. 鉻渣堆放場中金屬鉻對周邊土壤微生物毒性效應[J]. 中南大學學報 (自然科學版) ，2009，40 (1):25-30.

Huang Shunhong, Yang Zhihui, Chai Liyuan, et al. Toxicity of Metal Chromium to Microorganism Activities in Soil Around Chromium-Containing Slagheap [J]. Journal of Central South University (Science and Technology) , 2009, 40 (1): 25-30.

[9] Guoping T, Watson D B, Wei M W, et al. U(Ⅵ) Bioreduction with Emulsified Vegetable Oil as the Electron Donor：Model Application to a Field Test [J]. Environmental Science And Technology, 2013,47 (7):3218-3225.

[10]Tessier A,Campbell P G C, Bisson M. Sequential Extraction Procedure for the Speciation of Particulate Trace Metals [J]. Analytical Chemistry, 1979,51 (7): 844-851.

[11] 湯潔，王卓行，徐新華. 鐵屑-微生物協同還原去除水體中Cr(Ⅵ)研究[J]. 環境科學, 2013,34 (7):2650-2657.

Tang Jie, Wang Zhuoxing, Xu Xinhua. Removal of Cr (Ⅵ) by Iron Filings with Microorganisms to Recover Iron Reactivity [J]. Environmental Science, 2013,34 (7):2650-2657.

[12] 毛暉，曲東，周莉娜. 稻田土壤中添加不同濃度鉻對異化鐵還原和鉻還原的影響[J]. 中國農學通報, 2005,21 (6):235-237.

Mao Hui, Qu Dong, Zhou Lina. Effect of Variant Chromate and Ferrihydrite on Dissimilatory Fe (Ⅲ) Reduction in Paddy Soil [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2005,21 (6):235-237.

[13] 黎慧娟，彭靜靜. 異化Fe (Ⅲ) 還原微生物研究進展[J]. 生態學報，2012，32 (5):1633-1642.

Li Huijuan, Peng Jingjing. Recent Advances in Studies on Dissimilatory Fe (Ⅲ) -Reducing Microorganisms [J]. Acta Ecologica Sinica, 2012,32 (5):1633-1642.

[14] Peng L, Liu Y, Gao S H, et al. Assessing Chromate Reduction by Dissimilatory Iron Reducing Bacteria Using Mathematical Modeling [J]. Chemosphere, 2015,139:334-339.

[15] 陳子方. 工業糖漿原位修復Cr (Ⅵ) 污染地下水反應機理及效能實驗研究[D]. 長春:吉林大學，2016：30-34.

Chen Zifang. Study on the Mechanisms and Efficiency of In-Situ Remediation of Cr (Ⅵ) Contaminated Groundwater with Syrup[D]. Changchun: Jilin University, 2016: 30-34.

[16] Eric E R, Matilde M U. Influence of Biogenic Fe(Ⅱ) on Bacterial Crystalline Fe(Ⅲ) Oxide Reduction [J]. Geomicrobiology Journal, 2002,19 (2):209-251.

[17] Thomas B, Ruben K, Andreas K, et al. Biogeoche-mical Redox Processes and Their Impact on Contaminant Dynamics [J]. Environmental Science and Technology, 2010,44 (1):15-23.

[18] 張蘭英，劉娜，王顯勝.現代環境微生物技術[M]. 3版. 北京：清華大學出版社, 2005：127，139-142.

Zhang Lanying, Liu Na, Wang Xiansheng. Modern Environmental Microbial Technology [M].3rd ed. Beijing: Tsinghua University Press, 2005:127,139-142.

[19] Boris F, Hazen T C, Long P E, et al. In Situ Long-Term Reductive Bioimmobilization of Cr (Ⅵ) in Groundwater Using Hydrogen Release Compound [J]. Environmental Science And Technology, 2008,42 (22):8478-8485.

[20] Hansel C M, Wielinga B W, Fendorf S. Structural and Compositional Evolution of Cr/Fe Solids After Indirect Chromate Reduction by Dissimilatory Iron-Reducing Bacteria [J]. Geochimica Et Cosmochimica Acta, 2003,67 (3):401-412.

[21] Guertin J, Jacobs J, Avakian C P. Chromium(Ⅵ) Handbook [M]. Boca Raton: CRC Press, 2004:71-72.

[22] Paul L, Smolders E. Inhibition ofIron(Ⅲ) Minerals and Acidification on the Reductive Dechlorination of Trichloroethylene [J]. Chemosphere, 2014,111:471-477.

[23] Borden R C. Effective Distribution of Emulsified Edi-ble Oil for Enhanced Anaerobic Bioremediation [J]. Journal of Contaminant Hydrology, 2007,94 (1/2):1-12.

[24] Li Z, Wrenn B A, Venosa A D. Effect ofIron on the Sensitivity of Hydrogen, Acetate, and Butyrate Metabolism to Inhibition by Long-Chain Fatty Acids in Vegetable-Oil-Enriched Freshwater Sediments [J]. Water Research, 2005,39 (13):3109-3119.

[25] Robert C B, B Ximena Rodriguez. Evaluation of Slow Release Substrates for Anaerobic Bioremediation [J]. Bioremediation Journal, 2006,10 (1):59-69.

[26] 生賀.乳化油反應帶強化修復Cr (Ⅵ) 污染地下水研究[D]. 長春:吉林大學，2015：38-40.

Sheng He. Study on Enhanced Remediation of Cr(Ⅵ) Contaminated Groundwater by Emulsified Oil Reaction Zone [D]. Changchun: Jilin University, 2015:38-40.

[27] 張壘. 鉻污染的城市土壤毒性與修復研究[D]. 成都:四川農業大學，2012：6-7.

Zhang Lei. Toxicity of Chromium Contaminated in Urban Soiland Phytoremediation [D]. Chengdu: Sichuan Agricultural University, 2012:6-7.