基于上轉換熒光納米粒子和金納米粒子間熒光共振能量轉移的高靈敏赭曲霉毒素A檢測方法研究

張瑩瑩，錢志娟，謝正軍，彭池方,3*

(1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122;2.揚州出入境檢驗檢疫局，江蘇 揚州 225000;3.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122)

赭曲霉毒素(Ochratoxins)是由曲霉屬的7種曲霉和青霉屬的6種青霉菌產生的一組真菌毒素，包括赭曲霉毒素A(Ochratoxin A ，OTA)、赭曲霉毒素B(Ochratoxin B，OTB)、赭曲霉毒素C(Ochratoxin C，OTC)、赭曲霉毒素α(Ochratoxin α，OTα)，其中OTA的毒性最大、分布最廣、對農產品污染最重、與人類健康關系最為密切[1]。OTA廣泛存在于各種食品和飼料中，如咖啡、酒類、堅果、谷物等[2]。OTA對人類和動物的毒性作用主要是致畸、致癌、致突變、腎臟毒、肝毒以及免疫抑制[3]，國際癌癥組織(IARC)將其定為2B類致癌物[4]。目前，檢測OTA的方法主要有免疫化學分析方法[5-6](ELISA)、薄層色譜法[7](TLC)、高效液相色譜法(HPLC)[6,8-9]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[10-11]、表面增強拉曼光譜[12-13](SERS)及電化學檢測法[14-16]等。這些方法精度好、靈敏度高、特異性強，但存在耗時長、儀器昂貴、需專業人員操作、操作復雜、不便攜帶等不足，不利于實際應用。因此，開發一種簡單方便、成本低、靈敏度高、特異性好的OTA快速檢測方法具有重要的應用價值。

熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET) 作為一種均相分析檢測技術,由于操作簡單、靈敏度高、選擇性好、時間和空間分辨率高等優點,近年來在食品安全檢測領域得到廣泛應用。FRET是指兩個不同的熒光基團,其中1個熒光基團作為能量供體(Donor),另1個作為能量受體(Acceptor),當能量供體的發射光譜與能量受體的激發光譜能夠有效重疊,并且二者之間的距離處于1.0～10.0 nm之間,用能量供體的激發光來激發時,會觀察到供體的能量向受體轉移，發生一種非輻射的能量轉移[17]。對于提高FRET的效率，選擇合適的供體和受體非常關鍵。相對于傳統的有機染料以及半導體量子點等下轉換熒光供體，上轉換熒光材料(Upconversion nanoparticles,UCNPs)由于優異的光化學特性備受研究者青睞。上轉換熒光材料發光由近紅外光(尤其是980 nm)激發，在可見光區發射[18]，克服了生物組織自體熒光干擾和組織穿透深度不足等問題[19]。同時，UCNPs還具有較高的光穩定性及化學穩定性、較低的生物毒性、較大的比表面積、較低的成本[20-21]；并且由于較窄的激發和發射光譜以及較大的斯托克斯位移，避免了背景及受體發光信號的干擾，提高了檢測的靈敏度[22]，因此，UCNPs是FRET的理想供體。例如，Wu等[23]利用UCNPs及碳納米粒子之間的FRET效應來檢測癌胚抗原；Saleh等[24]利用UCNPs及金納米粒子之間的FRET效應檢測了生物素及親和素之間的相互作用；Long等[25]利用UCNPs與金納米粒子之間靜電作用產生的FRET效應來檢測有機磷農藥。

在以UCNPs作為能量供體的FRET反應中，金納米粒子(AuNPs)由于較高的消光系數及猝滅效率被廣泛用作能量受體[21,26]。本實驗將UCNPs及AuNPs分別修飾OTA適配體和互補鏈制成能量供體探針及受體探針，利用核酸雜交反應拉近兩種材料的空間距離，實現FRET和UCNPs熒光猝滅；進一步加入OTA后，UCNPs熒光恢復，實現對OTA的定量檢測。該方法具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本較低等優點。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設備

YCl3·6H2O(99.99%)、YbCl3·6H2O(99.9%)、ErCl3(99.9%)、1-十八烯(1-ODE，90%)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、嗎啉乙磺酸(MES)、硫酸慶大霉素，以上試劑購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚丙烯酸(PAA，相對分子質量2 000)購自上海麥克林生化科技有限公司;1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、N-羥基琥珀酰亞胺磺酸鈉鹽(sulfo-NHS)購自西格瑪奧德里奇(上海)有限公司；甲醇、乙醇、油酸(OA)、二甘醇(DG)、乙二醇(EDG)、甲苯、氫氧化鈉(NaOH)、氟化銨(NH4F)、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)等試劑購自國藥集團化學試劑有限公司；赭曲霉毒素A購自江蘇美正生物科技有限公司；黃曲霉毒素B1購自瑪雅試劑有限公司；交鏈孢酚單甲醚、交鏈孢酚購自青島普瑞邦生物工程有限公司；實驗用水為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水，其余試劑均為市售分析純。赭曲霉毒素A適配體序列[27]為氨基修飾：5'-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-NH2-3'，赭曲霉毒素A適配體互補序列為巰基修飾：5'-CCT TTA CGC CAC CCA CAC CCG ATC-SH-3'，以上所有寡核苷酸序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

F-7000 全波長熒光掃描儀(日本日立有限公司)；980 nm 半導體激光器(北京海特光電有限責任公司)；紫外分光光度計(UV-2802 pcs，優尼柯公司)；透射電鏡(JEOL-2100，日本電子株式會式)；VS-100C恒溫混勻儀(無錫沃信儀器有限公司)；傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司)；X射線衍射儀(德國布魯克科技有限公司)；HI-6A型數字控溫磁力攪拌電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)；分析天平、pH計(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；高速冷凍離心機(上海力申科學儀器有限公司)；超聲波清洗儀(上海卓博精密機械有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1金納米粒子的制備金納米粒子(AuNPs)采用檸檬酸三鈉還原的方法合成[28]：將100 mL 0.01%的氯金酸溶液加入錐形瓶中攪拌加熱至沸騰；保持沸騰5 min后，將2 mL 1%的檸檬酸三鈉快速加入上述溶液；繼續加熱至溶液顏色變為酒紅色，再煮沸10 min停止加熱，攪拌冷卻至室溫。所得AuNPs的濃度為3 nmol/L。

1.2.2上轉換熒光納米材料的制備及表面改性根據文獻[29]的方法用高溫熱解法合成NaYF4∶Yb,Er UCNPs：取0.208 0 g YCl3·6H2O、0.110 8 g YbCl3·6H2O和0.007 8 g ErCl3加入燒瓶中；然后加入6 mL 油酸及15 mL 1-十八烯，將上述混合溶液攪拌加熱至160 ℃；待形成透明溶液后，冷卻至室溫；將10 mL甲醇溶液(含有0.1 g NaOH，0.148 2 g NH4F)緩慢加至上述溶液中攪拌30 min；然后將上述溶液加熱至100 ℃，100 ℃加熱30 min以除去甲醇；最后將溫度升至300 ℃ ，并在氬氣的保護下反應1 h；反應完成后冷卻至室溫，所得溶液用乙醇沉淀離心清洗3次，即得油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs。

油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs溶于非極性溶劑，為將其用于生物標記等，根據文獻[30]方法利用鏈交換法對其進行表面改性，使其可以溶于極性溶液：首先將150 mg 聚丙烯酸加入30 mL二甘醇中；將混合物加熱到110 ℃，待形成透明溶液后，加入50 mg 油酸包被的NaYF4∶Yb,Er UCNPs甲苯溶液2 mL；在氬氣的保護下110 ℃保持1 h，然后升溫至240 ℃反應2 h，反應結束后待溶液冷卻至室溫；加入乙醇沉淀材料，離心收集并用乙醇和水分別清洗3次，即得水溶性的PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs。

1.2.3赭曲霉毒素A能量供體探針的制備稱取5 mg PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs分散于5 mL10 mmol/L的MES溶液(pH 5.6)中，超聲至充分溶解；加入0.6 mL 2 mg/mL的EDC溶液及0.2 mL 2 mg/mL的NHS 溶液，將上述溶液混勻后于37 ℃活化2 h；離心收集材料并用10 mmol/L pH 7.0的PB緩沖液清洗3次，最后重懸于5 mL PB緩沖液中，并加入10 μL 100 μmol/L的OTA適配體37 ℃過夜孵育；孵育完成后，離心收集沉淀并用PB緩沖液清洗3次，得到OTA適配體修飾的上轉換熒光納米探針apt-UCNPs，將其重懸于BB 緩沖液(10 mmol/L Tris，pH 8.5，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl 和 20 mmol/L CaCl2)中，4 ℃保存。所得apt-UCNPs質量濃度為 1 mg/mL。

1.2.4赭曲霉毒素A能量受體探針的制備取1 mL AuNPs溶液與2 μL 500 μmol/L的OTA適配體互補鏈混勻，37 ℃孵育30 min；然后加入500 mmol/L pH 3.0的檸檬酸鹽5 μL，混勻后37 ℃孵育2 h；孵育完成后12 000 r/min離心15 min，得到OTA適配體互補鏈修飾的金納米粒子 cDNA-AuNPs，將其重懸于1 mL 10 mmol/L PBS緩沖液中，4 ℃保存備用。

1.2.5赭曲霉毒素A的檢測將100 μL 0.1 mg/mL apt-UCNPs用稀釋10倍后的BB緩沖液(0.1BB緩沖液)稀釋，與40 μL cDNA-AuNPs室溫孵育1 h后；加入60 μL不同濃度的OTA標準品(0.1BB緩沖液稀釋)繼續孵育1 h，利用980 nm激光源激發反應溶液，測量其熒光強度。

1.2.6特異性分析分別配制質量濃度均為10 μg/L的赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、硫酸慶大霉素、交鏈孢酚單甲醚和交鏈孢酚(Alternariol，AOH)標準品溶液。利用上述適配體傳感器測定熒光強度，通過對比熒光強度的變化值來評價構建的OTA適配體傳感器的特異性。

1.2.7加標回收實驗首先對超市所購買的啤酒樣品進行預處理[31]：取脫氣酒類試樣(含CO2的酒類樣品先置于4 ℃冷藏30 min，過濾或者超聲)20 g，置于25 mL容量瓶中，加提取液(稱取 150 g 氯化鈉、20 g 碳酸氫鈉，加水定容至 1 L)定容至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾至濾液澄清，收集濾液備用。將3種不同濃度的OTA標準品加入稀釋5倍的市售啤酒樣品中，利用上述OTA適配體傳感器檢測OTA含量，計算回收率。

圖1 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(A) 與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(B)的TEM圖以及OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs相同濃度下的熒光光譜圖(C)Fig.1 TEM images of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(A) and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(B),and fluorescence spectra of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs(C)

2 結果與討論

2.1 納米材料的表征

2.1.1上轉換熒光納米材料的表征通過透射電鏡(TEM)觀察可知，油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs在甲苯中的單分散性良好，粒徑約為35 nm(圖1A)；通過PAA改性后的NaYF4∶Yb,Er UCNPs在水中的單分散性依舊良好，粒徑約為43 nm(圖1B)。由熒光光譜圖(圖1C)可見，NaYF4∶Yb,Er UCNPs于980 nm激發下，在532、546、662 nm處有明顯的特征發射峰，其分別代表了2H11/2、4S3/2及4F9/2向4I15/2的能級躍遷[32]。雖然PAA改性后的NaYF4∶Yb,Er UCNPs相對于油酸包裹的NaYF4∶Yb,Er UCNPs的熒光強度減弱，但并不影響后續使用。

通過X射線衍射圖譜(XRD，圖2)可知，材料改性前后晶相的 XRD 峰與標準卡 JCPDS NO.28-1192 的出峰位置相匹配，說明材料改性前后的晶相均屬于六方相，具有較高的結晶度；經過鍵交換改性后，晶相并未改變。由傅立葉紅外圖譜(FT-IR)(圖3)可知，OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在2 924 cm-1和 2 854 cm-1處分別有亞甲基(—CH2—)的非對稱和對稱伸縮振動峰，在 1 568 cm-1和 1 465 cm-1處有羧基(COO—)的非對稱和對稱伸縮振動峰；進行鏈交換之后，PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在2 926 cm-1處—CH2—的吸收峰幾乎消失，而在 1 732 cm-1及1 409 cm-1處出現強羧基吸收峰，表明PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs表面的羧基數量增加并且取代了油酸陰離子。

2.1.2金納米粒子的表征通過TEM觀察可知(圖4A)，AuNPs的粒徑大約為25 nm，單分散性良好。由紫外吸收光譜(圖4B)可知，AuNPs在523 nm處有最強吸收，其縱向吸收峰與PAA-NaYF4:Yb,Er UCNPs的發射光譜有很大程度的重合，有助于提高熒光共振能量轉移效率。

圖2 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的XRD圖Fig.2 XRD patterns of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs

圖3 OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs及PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的FT-IR圖Fig.3 FT-IR spectra of OA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs

圖4 AuNPs的TEM圖(A)與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs的熒光光譜及AuNPs的紫外吸收光譜(B)Fig.4 TEM image of AuNPs(A) and fluorescence spectrum of PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs and UV-Vis spectrum of AuNPs(B)

2.2 赭曲霉毒素A能量供體及受體探針的表征

圖5 apt-UCNPs，apt-UCNPs與AuNPs孵育，apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育，apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育后加OTA孵育的熒光光譜圖Fig.5 Fluorescence spectra of apt-UCNPs，apt-UCNPs+AuNPs，apt-UCNPs+cDNA-AuNPs and apt-UCNPs+cDNA-AuNPs+OTA

AuNPs的紫外吸收光譜顯示，AuNPs在與巰基化的OTA適配體互補鏈孵育連接后，在260 nm出現DNA的最大吸收峰，說明AuNPs與OTA適配體互補鏈形成了Au—S鍵，cDNA成功連接到AuNPs表面；AuNPs加入NaCl后很容易聚集，而cDNA-AuNPs具有較高的耐鹽性，進一步證明了cDNA已連接到AuNPs表面，成功制備能量受體。而NaYF4∶Yb,Er UCNPs的紫外吸收光譜顯示，PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs在紫外區沒有吸收，在與氨基化的OTA適配體孵育連接之后，在260 nm處出現了DNA的特征吸收峰，說明OTA適配體連接到PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs表面，成功制備能量供體探針。

本實驗的設計原理是基于能量供體和能量受體之間合適的空間距離和光譜的高度重疊實現熒光共振能量轉移，導致UCNPs的熒光猝滅；而當體系中加入OTA時，OTA優先與能量供體適配體結合，導致兩種探針的空間距離拉大，不再滿足FRET的發生條件，所以UCNPs被猝滅的熒光得以恢復。通過對照實驗來進一步證明此原理。由圖5的熒光光譜可知，apt-UCNPs與AuNPs孵育時并不會連接發生FRET導致熒光猝滅，只有修飾了cDNA-AuNPs才會與apt-UCNPs通過核酸雜交結合導致熒光猝滅；而當體系中加入OTA時，由于OTA與apt-UCNPs上OTA適配體的特異性結合，破壞了FRET，apt-UCNPs的熒光得以恢復。

2.3 基于上轉換熒光納米材料與金納米粒子熒光共振能量轉移檢測赭曲霉毒素A的方法研究

2.3.1赭曲霉毒素A適配體濃度的影響本實驗將OTA適配體連接PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs作為能量供體，其中OTA適配體的濃度會影響apt-UCNPs的猝滅程度，通過加入不同濃度的OTA適配體與PAA-NaYF4∶Yb,Er UCNPs結合來優化最佳濃度。實驗結果顯示，隨著OTA適配體濃度的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度I/I0(I0代表只有apt-UCNPs時的熒光強度，I代表加入cDNA-AuNPs時apt-UCNPs的熒光強度)不斷增強，當OTA適配體濃度增加至100 μmol/L時，猝滅達到飽和，因此選擇100 μmol/L作為OTA適配體的濃度。

2.3.2BB緩沖液濃度的優化高濃度的BB緩沖液可能會導致cDNA-AuNPs的聚集，低濃度的BB緩沖液不利于apt-UCNPs與OTA及cDNA-AuNPs的結合[33]，從而影響熒光共振能量轉移，因此需通過不同濃度的BB緩沖液稀釋apt-UCNPs來優化BB緩沖液的濃度。結果顯示，當BB緩沖液稀釋倍數為10時，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度最高，因此選擇稀釋10倍的BB緩沖液(0.1BB)用于后續實驗。

2.3.3能量受體探針體積的影響能量受體cDNA-AuNPs的濃度會影響apt-UCNPs的猝滅程度以及熒光恢復程度，從而影響檢測的靈敏度。通過改變cDNA-AuNPs的體積來改變體系中cDNA-AuNPs的濃度優化出最佳的猝滅效果。實驗發現，隨著cDNA-AuNPs體積的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度I/I0不斷增強。當達到40 μL時，猝滅接近飽和；繼續增大cDNA-AuNPs的體積，猝滅效果會更好，但過量的cDNA-AuNPs易導致非特異性猝滅，不利于熒光恢復，因此選擇cDNA-AuNPs的體積為40 μL。

2.3.4能量供體探針濃度的影響能量供體探針的濃度會影響猝滅效果，進而影響檢測的靈敏度，因此對apt-UCNPs的濃度進行了優化。結果表明，當apt-UCNPs為0.1 mg/mL 時，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅效果最好；隨著apt-UCNPs濃度的增大，猝滅效果減弱，因此選擇apt-UCNPs的質量濃度為0.1 mg/mL。

2.3.5能量供體及受體探針反應時間的影響由于堿基互補配對使能量供體apt-UCNPs與能量受體cDNA-AuNPs結合發生熒光共振能量轉移現象，導致能量供體apt-UCNPs的熒光猝滅。將apt-UCNPs與cDNA-AuNPs孵育不同的時間，通過對比apt-UCNPs的猝滅程度來選出最佳的孵育時間。結果顯示，隨著時間的增加，apt-UCNPs在546 nm處的猝滅程度不斷增加。當孵育60 min時，猝滅程度達到最大；之后，隨著反應時間的增加，猝滅程度基本保持不變，說明apt-UCNPs與cDNA-AuNPs已經完全結合，因此選擇apt-UCNPs與cDNA-AuNPs的反應時間為60 min。

2.3.6赭曲霉毒素A孵育時間的影響apt-UCNPs與cDNA-AuNPs結合發生熒光共振能量轉移導致apt-UCNPs的熒光猝滅；而OTA的加入會使得OTA適配體改變空間結構與OTA結合形成復合物，使得apt-UCNPs與cDNA-AuNPs分離，兩者之間的距離拉大，apt-UCNPs的熒光得到恢復。為了達到最佳的熒光恢復效果，需對OTA的孵育時間進行優化。將OTA標準液加入能量供體及受體反應后的體系中，結果顯示，隨著孵育時間的增加，apt-UCNPs在546 nm處的熒光恢復率(Ia-I)/I0(式中，I0代表只有apt-UCNPs時的熒光強度，I代表加入cDNA-AuNPs時apt-UCNPs的熒光強度，Ia代表apt-UCNPs和cDNA-AuNPs反應后的體系中加入OTA之后的熒光強度)不斷增加。當孵育60 min后，熒光恢復達到最大；之后基本保持平衡，因此選擇OTA的孵育時間為60 min。

2.3.7赭曲霉毒素A檢測的標準曲線利用cDNA-AuNPs導致apt-UCNPs熒光猝滅，而OTA的加入對apt-UCNPs起到熒光恢復的作用，構建了OTA適配體傳感器。在上述最優實驗條件下，得到加入不同濃度OTA孵育后的熒光光譜。當OTA質量濃度在0.001～10 ng/mL范圍內時,apt-UCNPs 在546 nm處的熒光恢復率(Ia-I)/I0與OTA的濃度呈線性關系，線性方程為y=0.077 22logx+0.033 88，r2=0.980 5，檢出限(S/N=3)為0.001 ng/mL。與基于納米材料檢測OTA的其他方法作比較(表1)，結果發現該方法與其他方法相比具有一定的優勢。

表1 幾種基于納米粒子檢測OTA的方法比較Table 1 Comparison of several methods for OTA detection based on nanoparticles

2.4 特異性分析

選用黃曲霉毒素B1(AFB1)、硫酸慶大霉素(GS)、交鏈孢酚單甲醚(AME)和交鏈孢酚(AOH)作為可能的共存毒素作特異性研究。結果顯示，10 ng/mL的其他毒素對于反應體系的熒光強度沒有明顯的熒光恢復作用，這說明本實驗所構建的OTA適配體傳感器具有良好的特異性。

2.5 啤酒樣品加標回收實驗

為了檢驗該反應體系的實用性，將其應用于市售啤酒樣品的加標回收檢測。結果如表2所示，回收率為100%～119%，相對標準偏差(RSD)為4.3%～4.9%，說明本方法在實際樣品的檢測中具有一定的準確性及可靠性。

表2 啤酒樣品中OTA的加標回收實驗(n=3)Table 2 Recovery results of added standard OTA in beer samples using the method(n=3)

3 結 論

本研究通過上轉換熒光納米材料與金納米粒子之間的熒光共振能量轉移建立了OTA適配體傳感器。經過對檢測條件的優化發現，當cDNA-AuNPs的體積為40 μL，apt-UCNPs的質量濃度為0.1 mg/mL，探針之間及靶標孵育時間為60 min時,OTA的檢測范圍為0.001～10 ng/mL，檢出限可達0.001 ng/mL。經過特異性研究及加標回收實驗，證明該方法可用于實際樣品檢測，具有方法靈敏度高、特異性好、操作簡單、成本低的優點，有望應用于食品等領域中OTA的檢測。

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