氣相色譜法同時快速測定食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸及脫氫乙酸

高海軍，范自營，張紅云，高敬銘，郭 靜

(1. 河南省糧油飼料產品質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450008；2.中儲糧油脂(新鄭)有限公司，河南 新鄭 451100)

防腐劑是防止食品腐敗變質、延長食品儲存期的一類物質[1]，是食品常用的添加劑類別之一。據調查有標注添加防腐劑的食品樣本占總樣本的52.36%，標注添加山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸、丙酸及其鹽的樣本占標注添加防腐劑食品樣本的74.29%，排名分別為第一、第二、第四和第七位，說明上述4種物質是我國食品防腐劑中主要添加的品種[2]。大量的研究結果表明上述4種防腐劑比較安全，但過量使用仍會對人體產生一定的傷害；在一定程度上抑制骨骼生長，危害腎、肝臟的健康，導致體重下降、腹瀉以及胃黏膜永久性損傷等[3-6]。各國對其在食品中的含量都有嚴格的規定[7]，在我國現行的食品安全國家標準(GB 2760—2014 食品添加劑使用標準)中對上述4種防腐劑在食品中的含量也有明確規定，屬限制使用含量的食品添加劑；一些食品生產廠家和手工作坊往往為延長食品保質期，過量使用這4種防腐劑；據本中心在2015年的一次市場食品樣本抽檢發現，4種防腐劑的總超標率在6%左右，甚至在一部分未標注上述4種防腐劑的食品中也有檢出。因此，4種防腐劑的檢測是食品安全監管必不可少的檢測項目。

目前檢測食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸及其鹽的國標方法主要有氣相色譜法、液相色譜法以及薄層色譜法，僅僅山梨酸、苯甲酸可以同時檢測。若使用國標方法檢測上述4種物質至少需要3種方法進行檢測[8-12]。另外，由于食品基質復雜，大部分方法的前處理過于復雜，造成檢測效率低下、費時費力。近幾年，多種防腐劑同時檢測的方法已有不少[13-17]。隨著質譜聯用儀器的推廣，也出現了氣相色譜質譜聯用法和液相色譜質譜聯用法[18-19]。但這些方法都局限于某種具體的食品，適用性差。且大部分方法的前處理仿照國標方法，雖然凈化效果較好，但存在前處理復雜、試劑消耗量大、不利于環保、檢測效率低、重復性、回收率、檢出限都很難保證等問題[20-21]。給含這4種防腐劑食品的安全監督檢驗工作增加了很大難度。急需建立一個適用范圍廣、效率高且重現性和檢出限都符合要求的檢測方法。

本實驗研究建立一次處理即可同時檢測這4種防腐劑的方法。該方法具有適用范圍廣、效率高、重現性好、檢出限低等特點，而且4種防腐劑在有雜質干擾時，可用不同的極性毛細管柱做進一步的確認。對我國食品安全的監督檢驗和對添加一種或多種上述4種防腐劑的食品生產質量監控有著很大的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

風味小食品，醬菜，豆制品等。

1.1.2 標準物質

丙酸(色譜純，≥99.5%)：天津市博迪化工有限公司；山梨酸(99.0%±1%)：國家標準物質研究中心；苯甲酸(99.95%～100.05%)：上海同濟微量元素研究所；脫氫乙酸(98%)：Alfa Aesar公司。

1.1.3 試劑

所用試劑無特殊說明外，均為分析純；水為實驗室用三級水。石油醚(沸程60～90 ℃)、乙醚，均需重蒸餾；碳酸氫鈉，氯化鈉，鹽酸。

1.1.4 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜儀：美國Agilent公司；TGL-20B高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；MTV-100多管渦旋混合儀：北京優晟聯合科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

10 g/L碳酸氫鈉水溶液：稱取10.00 g碳酸氫鈉，用水溶解后定溶至1 000 mL。

石油醚—乙醚混合溶液：3體積的石油醚和1體積的乙醚混合均勻。

鹽酸溶液：將100 mL 鹽酸加入到100 mL蒸餾水中，混合均勻。

標準混合儲備液：準確稱取丙酸、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸標準物質各 0.100 0 g，溶于100 mL 容量瓶中，用石油醚—乙醚混合溶液溶解定容至刻度，該溶液每毫升相當于 1 mg 上述各標準物質。

標準混合使用液：分別移取上述標準混合儲備液 1.00、2.00、4.00、8.00、16.00 mL，用石油醚—乙醚混合溶液分別稀釋定容至50 mL，每毫升含上述各標準物質分別為20、40、80、160、320 μg。

所有不同濃度標準溶液均保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 樣品前處理方法

取適量食品樣品，用組織搗碎機或小型電動研磨機磨碎后，貯存于廣口瓶中冷藏備用。

準確稱取磨碎的食品樣品2～3 g于50 mL離心管中，加入25 mL10 g/L碳酸氫鈉水溶液，搖勻浸泡3 min，加入15 mL石油醚—乙醚混合溶液，渦旋或劇烈振搖1 min，靜置分層(若乳化可離心分層)，棄去上層溶液，若干擾物較多，可再次加入10 mL石油醚—乙醚混合溶液重復上述步驟，直至無明顯干擾物；將下層溶液置于50 ℃水浴中揮發至無明顯氣味，向離心管中加入1.0 mL鹽酸溶液，輕輕振搖至無明顯氣泡后加入適量氯化鈉，振蕩溶解至飽和，準確加入10 mL石油醚—乙醚混合溶液，劇烈振搖1 min，靜置分層(若乳化可離心分層)，上層溶液即為待測液。

1.2.3 色譜條件

氫火焰離子化檢測器(FID)，溫度：240 ℃；分流/不分流進樣口，溫度：230 ℃；載氣：高純氮氣(≥99.999%)，恒流模式進樣，流量：5 mL/min；進樣量：1.0 μL，分流比3∶1。

DB-FFAP色譜柱(30 m×530 μm×0.50 μm)，柱溫箱條件：初始溫度100 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至140 ℃，30 ℃/min升至170 ℃，10 ℃/min升至190 ℃，40 ℃/min升至230 ℃，保持3 min。

DB-608驗證柱(30 m×530 μm×0.83 μm)，柱溫箱條件：初始溫度60 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至80 ℃，30 ℃/min升至140 ℃，10 ℃/min升至170 ℃，30 ℃/min升至230 ℃，保持3 min。

1.2.4 測定

將1 μL標準系列中各濃度標準使用液注入氣相色譜分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。同樣分析樣品測試液，與標準曲線比較進行定量。

1.2.5 結果計算

樣品中的上述4種防腐劑含量分別以丙酸、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸計，按式(1)進行計算：

(1)

式中:X—樣品中防腐劑含量，g/kg；C—樣品測試液中各防腐劑濃度，μg/mL；V—測試提取液體積， mL；M—試樣質量， g。

若測定結果以丙酸鈉(鈣)、山梨酸鉀(鈉)、苯甲酸鈉(鉀)、脫氫乙酸鈉等計時，則測得的酸含量乘以換算系數即可得對應鹽的含量；換算系數為測定目標物鹽的分子量除以相應酸的分子量。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇和優化

在色譜條件的選擇中，最重要的是選擇合適的色譜柱，然后再做其它測試參數的優化。根據相關資料和相似相容原理，本方法選擇極性色譜柱作為測定這4種防腐劑的色譜柱。由于內涂物的不同同樣也會對目標物的分離、測定等產生影響，因此，為了篩選更好的色譜條件，本實驗采用3種不同性質的極性毛細管柱(分別為DB-FFAP，30 m×530 μm×0.50 μm；DB-608，30 m×530 μm×0.83 μm；LZP-930，25 m×530 μm×0.50 μm)對同一濃度的標準混合液(80 μg/mL)按1.2.3進行測試，并對測試條件進行優化，測試圖譜見圖1、圖2和圖3。

圖1 丙酸、山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸標準 混合使用液在DB-FFAP柱上的色譜圖

圖2 丙酸、山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸標準混合使用液 在DB-608柱上的色譜圖

圖3 丙酸、山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸標準混合使用液 在LZP-930柱上的色譜圖 注：柱溫箱條件：初始溫度80 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，其它參數同本文1.2.3。

從圖1、圖2和圖3可知，選用色譜柱對所測4種防腐劑都有很好的分離效果；但響應值明顯不同，DB-FFAP色譜柱最高，DB-608柱次之，LZP-930柱最低；丙酸、山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸的出峰順序和分離情況也不相同。由于目標物在DB-FFAP和DB-608色譜柱上的響應值差別不是很大，且脫氫乙酸和苯甲酸的出峰順序和每個目標物之間的相對保留時間也不相同，這樣可以利用此性質對測定中在一種柱子上存在干擾或假陽性的情況可更換成另一種色譜柱進行驗證。因此，選擇DB-FFAP色譜柱作為實驗的測定用柱，而DB-608色譜柱作為實驗排除干擾和假陽性的驗證用柱。LZP-930色譜柱由于目標物響應值低，造成檢出限偏高，因此不采用。

2.2 被測物的線性響應分析

被測物質在測定條件下，峰面積和濃度有良好的相關性響應是衡量該檢測方法好壞的重要因素。因此，本實驗對一系列不同濃度的標準溶液進行測定，濃度分別為10、20、40、80、160、320、1 000μg/mL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標建立標準曲線，其線性回歸方程和相關系數見下表1。

表1 4種防腐劑的標準曲線回歸方程及相關系數

從表1中可以看出：4種防腐劑在10～1 000 μg/mL的濃度范圍內具有很高的相關性，若利用本法進行檢測，則標準曲線的濃度范圍對應至樣品中的含量范圍為0.05～5.0 g/kg，完全涵蓋了4種防腐劑的常規添加量，說明本法的線性相關性能滿足實際樣品檢測要求。

2.3 方法前處理分析

麻辣小食品中含有較多的脂肪、色素、添加劑等是影響分析的干擾物質，難于處理凈化。本方法樣品處理過程在1只50 mL的離心管中進行，使用了振搖、離心等常規操作，其空白樣品圖譜和4種防腐劑的添加回收色譜圖見圖4和圖5。從圖4、圖5可以看出：本方法處理效果好，目標干擾物少。

圖4 麻辣小食品樣品空白測試色譜圖

圖5 麻辣小食品樣品添加回收測試色譜圖

2.4 方法的準確度

方法的準確度通常用添加回收率來反映。本實驗以較難處理的幾種常見固體非脂類食品作為方法的驗證對象，向樣品中添加不同濃度的4種防腐劑標物，混勻后進行檢測，計算其回收率，測定結果見表2。

從表2可知，山梨酸的回收率在95.4%～98.6%之間，脫氫乙酸的回收率在96.2%～99.4%之間，苯甲酸的回收率在95.2%～96.9%之間，加標量高的比加標量低的回收率高，主要是由于系統性測量損失造成的；這3種防腐劑的最低回收率均在95%以上，結果符合《GB/T 27404—2008 實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F—檢測方法確認技術要求中關于回收率的要求。

表2 4種防腐劑在不同食品中的回收率 %

注：1#樣品4種防腐劑的添加濃度均為0.5 g/kg，2#樣品4種防腐劑的添加濃度為 0.1 g/ kg。

丙酸的回收率在85.1%～91.3%之間，丙酸回收率相對較低是因為丙酸具有與水互溶的性質，造成丙酸很難從水中提取出來，這也是氣相色譜法測定丙酸普遍遇到的問題，屬較難處理物質。另外，本實驗對不同方法測定相同添加量(0.1 g/kg)下的丙酸回收率進行了比對，見圖6。從圖6可知，本方法測定丙酸的回收率和國標方法GB 5009.120—2016 《食品安全國家標準食品中丙酸鈉、丙酸鈣的測定》第二法—氣相色譜法的回收率基本相同，基質干擾較少的食品類樣品如豆腐、糕點等甚至高于國標方法。

圖6 不同方法檢測丙酸的回收率比對圖

從上述分析說明本法能滿足檢測需要，是一個適應范圍廣、準確度高的檢測方法。另外，若用本方法測定樣品中的丙酸，應注意在實驗過程中用氯化鈉充分飽和被提取的水溶液，以提高丙酸的回收率。

2.5 方法的精密度

本實驗往干擾較大的空白麻辣小食品中加入較低量的4種標準物質(0.1 g/kg)，充分混勻后測定 6次，計算測定結果的實驗室內變異系數CV值(相對標準偏差RSD)來表示方法的精密度。結果見表3。

從表3 中可知，4種防腐劑測定結果的實驗室內變異系數CV(n=6)均小于5%，結果優于《GB/T 27404—2008 實驗室質量控制規范食品理化檢測》附錄F—檢測方法確認的技術要求中關于精密度的要求。

2.6 方法的檢測限

方法的檢出限是方法能不能滿足檢測要求的根本保證。利用本法進行檢測，檢出限為3倍噪音除以靈敏度(標準曲線方程的斜率)的計算結果[23]，結果見表3。

從表3可知，4種防腐劑的檢出限均在 0.002 g/kg以下，比上述幾種食品中國家規定的最低限量值(0.25 g/kg)還要低100 多倍，說明該法檢測限低，能滿足食品安全檢測的需要。

表3 4防腐劑的精密度實驗結果和檢出限

2.7 方法在實際檢測中的應用

利用本方法對市場上的風味小食品類、醬菜類、豆腐類、糕點類共計300 份食品樣品進行檢測，取得了很好的應用效果，工作效率比使用國標方法分開檢測提高10倍以上，樣品中檢出含有這4種防腐劑及其鹽的情況為：丙酸檢出率為14.0%，超標率為0.7%；山梨酸檢出率為55.7%，超標率為1.7%；脫氫乙酸檢出率為52.0%，超標率為2.3%；苯甲酸檢出率為45.3%，超標率為1.3%；大部分樣品中都添加了1～2種防腐劑。

3 結論

利用丙酸、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸及其鹽在堿性條件下溶于水，酸性條件下溶于有機溶劑的性質，采取先除干擾物再提取目標物的思路，以基質復雜的風味小食品、醬菜等作為驗證對象，研究建立了食品中丙酸、山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸及其鹽含量同時快速測定的檢驗方法，方法適用于固體非酯(脂)類食品的檢測。結果表明：丙酸的回收率在85.1%～91.3% 之間，其余 3 種防腐劑的回收率均在 95.2%～99.4%之間；實驗室內變異系數(CV，n=6)最大值≤4.7%，4種防腐劑的檢出限均在0.002 g/kg以下。4種防腐劑在使用DB-FFAP色譜柱測定中有雜質干擾時，可用DB-608毛細管柱做進一步的確認。本方法具有適用范圍廣、檢測效率高、重現性好、準確度高、檢出限低的特點，推廣應用對我國食品安全的監督檢驗具有重要的意義。

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