核桃油貯藏過程抗氧化能力的研究

彭星星 ，喬茜華 ，張紅云 ，高海軍 ，高敬銘 ，戴冠蘋 ，秦祎芳

(1.河南省糧油飼料產品質量監督檢驗中心，河南 鄭州 450000；2.國家電網公司運行分公司鄭州管理處，河南 鄭州 450000)

核桃為世界四大干果之一。我國也是核桃的原產地之一，栽培面積和產量均居世界之首。現今核桃已然成為了我國核桃主產區鄉村經濟的支柱產業之一，在推動農業結構調整、提高農民收入和保障我國食用油供給安全等方面起到了重要的作用。祖國醫學指出，核桃性溫、味甘、無毒，有健胃、補血、潤肺、養神等成效[1]。核桃具有很高的營養價值[2-5]，核桃含油量約為65%，被稱為“樹上的油庫”，核桃油脂肪酸組成主要是亞油酸、油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸,含量高達約為90%[6-7]，對于降低膽固醇防治冠心病、動脈硬化和心肌梗塞等疾病有很大作用[8-10]。核桃油中富含黃酮類物質[11-12],還含有神經酸、鱈油酸、EPA、DHA、角鯊烯、褪黑素、黃酮、胡蘿卜素等微量營養成分[13]，能夠防治動脈粥樣硬化[14]、具有抗氧化[15]等功效。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗用核桃油(冷榨法，無任何添加劑)取自陜西海源生態農業有限公司，在試驗前進行密封貯藏，防止其氧化變質。

1.1.2 試劑

1，1-二苯基-2-苦肼基DPPH，Sigma公司；維生素C，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲浣(Tris)，水楊酸，硫酸亞鐵，氫氧化鈉，98%濃硫酸，雙氧水，鹽酸，無水乙醇，試驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

EL-204型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；720紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；TDL-5低速離心機，賽默飛世爾科技公司；恒溫水浴鍋，太倉市試驗設備廠；pH計。

1.3 核桃油抗氧化能力的測定

1.3.1 核桃油清除DPPH·自由基能力試驗

DPPH·溶于乙酸乙酯中呈現出紫色，在波長515 nm處有最大吸收值，并且濃度和吸光度為線性關系，物質的抗氧化能力可以由物質對DPPH·的清除能力來表示。主要通過紫外分光光度法進行測定。

(1)稱取0.000 39 g DPPH，用乙酸乙酯定容至100 mL，得到濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液，低溫放置，待用；

(2)在10 mL的試管中分別加入含2 mL未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油、VC的乙酸乙酯溶液，濃度分別對應為0.03 g/mL、0.06 g/mL、0.09 g/mL、 0.12 g/mL、0.15 g/mL。之后再依次加入DPPH反應液4 mL，搖勻，放置暗處反應30 min，反應結束后，在515 nm波長處測定吸光度值；

(3)對照組為2 mL樣品加入4 mL乙酸乙酯溶液；空白組為2 mL乙酸乙酯溶液加入4 mLDPPH反應液。以乙酸乙酯溶液作為參比，測定其吸光度，記錄下吸光度值，由此計算DPPH.的清除率。

注：Ai—2 mL樣品溶液+4mLDPPH溶液測定的吸光度值。

Ai0—2 mL樣品溶液+4mL乙酸乙酯溶液測定的吸光度值。

A0—2 mL乙酸乙酯+4mLDPPH溶液測定的吸光度值。

1.3.2 核桃油清除羥基自由基能力試驗

Fenton反應是用二價鐵離子作為催化體系，用雙氧水作為氧化劑的氧化反應體系，在化學反應過程中可以產生羥基自由基，依據對水楊酸-乙醇反應體系的氧化情況，確定待測樣品能否對羥基自由基產生清除效果。在化學反應過程中，二價鐵離子被其氧化成三價鐵離子可能發生混凝反應從而生成沉淀。

(1)制備硫酸亞鐵溶液(6 mmol/L)：準確稱取0.083 4 g七水合硫酸亞鐵用少量蒸餾水溶解，然后轉移至50 mL 容量瓶中精確定容，獲得6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液；

(2)制備水楊酸-乙醇體系(6 mmol/L)：準確稱取0.041 4 g水楊酸溶于少量無水乙醇中，然后用無水乙醇溶液準確定容為50 mL(100 mL)，得到6 mmol/L水楊酸-乙醇體系；

(3)制備0.1%的雙氧水溶液：用微量移液器準確量取含30%濃度雙氧水溶液166.7 μL轉移至50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到0.1%的雙氧水溶液。

在10 mL的試管中分別加入1 mL 6mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 6mmol/L硫酸亞鐵溶液，之后分別加入1mL的樣品溶液(用無水乙醇定容)，濃度分別為0.03 、0.06、0.09、 0.12、0.15 g/mL，最后加入0.8 mL雙氧水溶液，使反應開始，搖勻，將其放置于37 °C水浴鍋中反應30 min，水浴反應完畢之后在3500 r/min速度下離心10 min，然后取上清液在510 nm波長處測定其吸光度值，以無水乙醇取代雙氧水作為對照組，以無水乙醇取代樣品溶液作為空白組。

注：Ai—為樣品的吸光度值。

Ai0—以無水乙醇代替雙氧水對照組的吸光度值。

A0—以無水乙醇代替樣品空白的吸光度值。

1.3.3 核桃油清除超氧陰離子自由基能力試驗

鄰苯三酚在弱堿性環境下(Tris-HCl溶液提供)能夠使自身發生氧化分解反應，生成超氧陰離子自由基。在反應進行過程中，超氧陰離子自由基不斷地增多，在這一過程中生成帶有顏色的中間產物，從而使反應溶液在波長420 nm下吸光度值在一段時間內隨時間變化而成線性增長關系。所以，在這一時間段內，吸光度的變化能夠反應樣品對超氧陰離子自由基的抑制能力。

(1)制備鄰苯三酚溶液(30 mmol/L)：準確稱取0.189 2 g鄰苯三酚，用10 mmol/L的鹽酸溶液溶解，定容于50 mL容量瓶中，此溶液需臨場配制；

(2)制備10 mmol/L HCl：加0.86 m L的濃鹽酸至1 000 mL的水中。

(3)Tris-HCl溶液(pH=8.2)：配制1L 0.05 M(50 mmol/L)Tris-HCl溶液，稱量7.88 g Tris-HCl置于1 L燒杯中，加入約800 mL左右的去離子水，用玻璃棒充分攪拌溶解后加入濃鹽酸調節至所需要的pH值，然后將溶液定容至1 L，經高溫高壓滅菌后，在室溫下保存。

(4)制備樣品溶液(1.0 mg/mL)：分別稱取0.025 g未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油、維生素C用無水乙醇定容至25 mL容量瓶中，得到1.0 mg/mL的樣品乙醇溶液和維生素C溶液。

具體實驗方法：分別稱取樣品未氧化核桃油、氧化10 d核桃油、氧化20 d核桃油、氧化30 d核桃油乙醇溶液、維生素C溶液(1.0 mg/mL)1.0mL，放置于10 mL試管中，之后加入pH為8.2的Tris-HCl溶液5.0 mL，鄰苯三酚溶液50 μL，迅速混勻，以蒸餾水為空白每30 s測定波長420 nm處的吸光度值。

注：Ai—(1 mL樣品溶液+5 mLTris-HCl溶液+50 μL鄰苯三酚溶液)的吸光值

A0—(1 mL蒸餾水+5 mLTris-HCl溶液+50 μL鄰苯三酚溶液)的吸光值

2 結果與分析

2.1 核桃油清除DPPH·自由基能力的研究

不同氧化天數的核桃油(Walnut Oil，下表中簡稱WO)樣品對DPPH·的清除能力如圖1所示：

圖1 不同氧化天數的核桃油對DPPH·的清除率

表1 不同氧化天數核桃油對DPPH·抑制的回歸曲線

樣品線性回歸方程IC50/(mg/mL)R2未氧化WOy=0.448x+15.8676.210.992氧化10dWOy=0.451x-0.989113.060.995氧化20dWOy=0.262x+3.350178.050.998氧化30dWOy=0.258x-0.650196.320.991VCy=0.333x+47.57.510.993

經比較發現，隨著濃度水平的增加，不同氧化天數的核桃油對DPPH·的抑制率也隨之增加，并且氧化時間越短，核桃油的清除效果越好，76.21mg/mL質量濃度未氧化核桃油清除DPPH·自由基的能力為50%，相當于7.51 mg/mL質量濃度 VC對DPPH·清除自由基的能力，相當于113.06 mg/mL質量濃度氧化10 d核桃油清除DPPH·的能力，相當于178.05 mg/mL質量濃度氧化20 d核桃油清除DPPH·的能力，相當于196.32 mg/mL質量濃度氧化30 d核桃油清除DPPH·的能力。此結論與孟阿會[17]的結果相一致，這可能是由于隨著氧化時間的增長，核桃油中的天然抗氧化成分如黃酮、生育酚等的含量也急劇降低，核桃油的抗氧化能力也逐漸減弱，清除DPPH·的能力也逐漸減低[20]。

2.2 核桃油清除羥基自由基能力的研究

不同氧化天數的核桃油樣品對·OH的清除能力如圖2所示：

圖2 氧化不同天數核桃油對·OH的清除率

表2 不同氧化天數核桃油對·OH抑制的回歸曲線

樣品線性回歸方程IC50/(mg/mL)R2未氧化WOy=0.469x+9.36286.650.991氧化10dWOy=0.349x+7.562121.600.991氧化20dWOy=0.249x+7.769169.600.990氧化30dWOy=0.236x+4.962190.840.991VCy=0.326x+49.51.530.992

經比較發現，86.65 mg/mL質量濃度未氧化核桃油清除·OH自由基的能力為50%，相當于1.53 mg/mL質量濃度 VC對OH·清除自由基的能力，相當于121.60 mg/mL質量濃度氧化10 d核桃油對·OH清除自由基的能力，相當于169.60 mg/mL質量濃度氧化20 d核桃油清除·OH的能力，相當于190.84 mg/mL質量濃度氧化30 d核桃油清除·OH的能力。隨著濃度水平的增加，不同氧化天數核桃油對·OH的抑制率增加，并且氧化時間越短，核桃油的清除效果越好。這可能是由于隨著氧化時間的增長，核桃油中的天然抗氧化成分如植物甾醇等的含量也急劇降低，核桃油的抗氧化能力也逐漸減弱[21]。

2.3 核桃油清除超氧陰離子自由基能力的研究

不同氧化天數的核桃油樣品及維生素C對超氧陰離子自由基的清除能力如圖3所示：

圖3 核桃油對超氧陰離子的清除率

樣品平均抑制率/%最大抑制率/%未氧化WO55.5390.84氧化10dWO38.4360.64氧化20dWO22.6043.84氧化30dWO15.4333.77VC56.1969.00

3 結論

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