儲藏稻谷中真菌的生長特性、監測及防控技術研究進展

張 威 周 濤 賀艷萍 王平坪 舒在習 孫朝軍

(武漢輕工大學食品科學與工程學院1，武漢 430023) (大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室2，武漢 430023) (湖北省農產品加工與轉化重點實驗室3，武漢 430023) (湖北中儲糧糧油質量檢驗中心4，武漢 430311)

稻谷是全球三大主糧之一，在我國飲食結構中占據重要的地位。我國稻谷種植面積約為3 000萬公頃，占全球種植面積的近20%。除糧食生產大國外，我國同時也是糧食消費大國，為保證糧食安全，國家在糧食戰略上制定了儲備糧政策[1-2]。2016年，我國稻谷總產量超2億t，其中稻谷存儲量超1億t。因自身生理生化變化及與外界環境間的相互作用，稻谷儲藏中可能遇到各種安全問題[3-4]。發現稻谷儲藏過程中存在的風險因素，并開發針對性的解決方案，有效減少儲藏損失一直是稻谷研究領域的熱點方向。

真菌在人類生活的環境中無處不在。長久以來，真菌被認為是影響稻谷安全儲藏的重要風險因素[5]。從生長到收儲，稻谷與空氣、水、土壤及動物等接觸均可能伴有真菌的污染。在儲藏環節，稻谷的儲存環境并非孤立不動的，而是在不斷變化的，真菌生長條件會隨環境變化而改變。當環境條件適宜真菌生長，真菌大量生長、繁殖，引起稻谷發熱、霉變及結塊等不利變化。一些真菌在生長過程中會產生真菌毒素，在稻谷中殘留后對人體危害極大[6-7]。為監測真菌生長，防止真菌在糧堆中進一步危害，科研人員及倉儲企業在真菌活動規律、監測方法方面開展了大量的研究工作。如在真菌數量和種群結構監測方面，在傳統的平板計數、孢子計數、鏡檢鑒定的基礎上，研發出二氧化碳法、近紅外法等一些新的方法。在掌握真菌活動規律及危害的同時，一些有效的防控手段也被針對性的研發并應用于稻谷儲藏的不同環節。本文圍繞真菌這一嚴重影響稻谷儲藏安全的微生物，介紹了儲藏中真菌的生長、監測及防控技術的現狀及發展趨勢，以期為其進一步研究提供參考。

1 儲藏稻谷中真菌的種類及生長影響因素

1.1 真菌的種類

儲藏稻谷中檢出的真菌種類較多，但目前研究多集中在對糧食安全有重要危害的霉菌上。不同霉菌在稻谷中的數量存在差異，而且儲藏期間菌種結構可能會發生改變。吳紅萍等[8]在對海南稻谷糧庫霉菌的調查中，檢出單端孢霉屬、鐮刀霉屬、木霉屬、頭孢霉屬、交鏈孢霉屬和曲霉屬。李新社等[9]在對湖南儲藏稻谷霉菌的污染調查中，主要檢出的霉菌為曲霉屬、青霉屬和毛霉屬，曲霉中主要帶毒菌含量由高到低分別為黃曲霉、雜色曲霉及構巢曲霉。Oh等[10]對韓國11個地區的微生物調查中，發現曲霉和青霉是優勢霉菌，其中前者在樣品中的數量更多。Ok等[11]對韓國6個區域80份新收稻谷樣品的霉菌調查中，發現鐮刀菌屬是優勢菌，其次是青霉屬、皰霉屬、漆斑菌屬、分子孢子菌屬；另外，鐮刀菌中，禾谷鐮刀菌是優勢菌種。都立輝等[12]在4個地區的淮稻5號稻谷中分離出真菌33株，主要包括青霉、曲霉和鐮刀菌等菌屬，其中青霉屬與曲霉屬為優勢菌，分別為16株和15株，該稻谷25 ℃下模擬儲藏6～8個月時出現的優勢菌株為橘灰青霉。Pinciroli等[13]在12個月的稻谷儲藏實驗中發現，真菌檢出頻率由高到低順序為田間真菌鏈格孢屬、黑孢子菌屬、附球菌屬、離蠕孢屬、彎孢屬、枝孢菌屬、鐮刀菌屬及儲藏真菌青霉屬、曲霉屬，田間真菌主要分布在稻殼和糠層，儲藏真菌主要分布在胚乳中，隨儲藏時間菌群結構動態變化。周建新等[14]發現稻谷霉變的優勢菌主要是曲霉屬，比較典型的有白曲霉、黃曲霉及米曲霉；儲藏初期以田間真菌為主，儲藏過程中，儲藏真菌逐漸成為優勢菌。

近年來的研究顯示，霉菌的菌群結構變化與產區、儲藏環境等因素有關。Makun等[15]對尼日利亞Niger州196份稻谷樣品進行了真菌調查，不同霉菌在各稻谷樣品中的檢出數總和達1 062，發現主要的污染真菌屬包括曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬、鏈格孢菌屬、白霉屬、根霉屬、木霉屬、彎孢屬、長蠕孢屬、枝孢屬，其中檢測霉菌菌種最多的是青霉菌、黃曲霉、寄生曲霉菌、黑曲霉、毛霉、根霉、交鏈孢霉，熱風、干熱及雨季最常見的霉菌分別是黑曲霉、青霉和黃曲霉。Reddy等[16]在印度20個稻谷種植州收集的1 200個稻谷和大米樣品(含525個大米樣品)中進行曲霉調查，發現所有稻谷均可檢出曲霉，其中黃曲霉、黑曲霉、赭曲霉及寄生曲霉是鑒定出的四種曲霉，不同地區曲霉的污染情況存在種類差異；對儲藏條件進行統計，發現黃曲霉和黑曲霉是儲藏期間的優勢菌群，開放條件儲藏(可以接觸雨水)的樣品中黃曲霉的污染程度明顯高于正常儲藏2～4年。楊基漢等[17]在模擬儲藏中發現，稻谷的優勢霉菌與稻谷初始水分有關，低初始含水量(10.6%和12.5%)稻谷儲藏優勢菌為黃曲霉，而高初始含水量稻谷(14.5%和16.6%)中白曲霉為優勢菌。唐芳等[18]發現灰綠曲霉和白曲霉是稻谷儲藏期間的優勢危害真菌，稻谷含水量16.0%左右為兩種曲霉生長優勢的轉折水分點，高于此水分后灰綠曲霉生長由強變弱，白曲霉生長由弱變強。

1.2 影響真菌生長的因素

稻谷中真菌(主要是霉菌)的生長與稻谷自身水分、儲藏環境因子等密切相關。Adhikarinayake等[19]在鋼混倉中對含水量14%新收獲稻谷進行儲藏的研究中，霉菌含量并未出現顯著變化。Aydin等[20]對土耳其稻谷產區100份未包裝稻谷的霉菌調查中，發現70份樣品中霉菌含量在1×101～1.5×104CFU/g，霉菌含量與稻谷含水量顯著正相關。周建新等[21]發現，儲藏溫度15 ℃和20 ℃下，稻谷中霉菌量變化較小，而溫度超過25 ℃時稻谷儲藏過程中水分散失較多，造成霉菌量下降。蘇文焯等[22]發現，含水量12.0%和12.8%的稻谷可長期安全儲藏，而含水量13.6%稻谷35 ℃以上儲藏49 d就存在霉變風險；溫度在15～40 ℃，霉菌生長速度與溫度成正比。張海洋等[23]發現，稻谷含水量對真菌生長起決定作用，含水量13.1%低于真菌生長臨界水分，溫度適宜真菌也不生長；14.0%高于真菌生長臨界水分，提高溫度和水分均會加速真菌生長度越快。唐小俊等[24]發現，高溫(30、35、40 ℃)條件下, 稻谷中霉菌含量隨濕度上升而增加；高濕(75%、85%、95%)條件下，霉菌數量隨溫度升高而增加。Choi等[25]在韓國稻谷中分別接種黃曲霉和禾谷鐮刀菌并在3種不同溫濕度條件下(21 ℃/85%RH、21 ℃/97%RH、30 ℃/85%RH)儲藏，發現黃曲霉在21 ℃/85%下無法生長，在另外2種條件下能生長，而禾谷鐮刀菌僅在21 ℃/97%RH下可以生長。Ji等[26]研究了室內儲藏稻谷中霉菌的生長規律，室內環境條件變化范圍為溫度22.6～27.0 ℃、相對濕度23.3%～44.2%，整個儲藏期間霉菌數量穩定，優勢菌包括白曲霉、黃曲霉、煙曲霉及青霉，總霉菌量與曲霉和青霉量均正相關，黃曲霉與總曲霉量和總霉菌量正相關。黃淑霞等[27]發現，稻谷水分活度升高將增強霉菌的活躍程度，另外，稻谷相比小麥和玉米顯示出更強抗霉菌生長的能力。Mousa等[28]研究了兩株不同黃曲霉菌(DISF10和DISF15)在稻谷中生長規律，發現水分活度0.82或溫度10 ℃和43 ℃下，兩株菌均無法生長；兩株菌在15 ℃下生長情況不同，DISF10生長最低水分活度為0.92，而DISF15則不同；兩株菌最適生長溫度均在30～32 ℃。

2 儲藏稻谷中真菌的監測方法

2.1 溫度監測法

稻谷倉儲實踐中，管理不善容易引起霉菌生長微環境的變化，霉菌劇烈活動釋放大量熱量，導致局部糧溫發生改變。糧庫在入糧過程中，向糧堆中埋入測溫電纜，監測糧堆不同部位的溫度分布，經與倉溫、氣溫及過往數據進行對比，判定糧溫異常位點[29-30]。然而，糧堆中的發熱不局限于霉菌活動，如昆蟲的大量活動也會導致熱量聚集，因此該法不具有專一性，在判斷霉菌行為時需結合其他監測方法進行分析。另外，霉菌生長積聚的熱量被測溫裝置檢測到時，稻谷霉菌帶菌量已經很大，因此通過糧溫監測霉菌生長具有一定的滯后性。

2.2 傳統平板培養與形態學分析

平板培養法在儲藏稻谷的真菌的數量監測和種類分析中使用較為廣泛，常使用的培養基包括孟加拉紅培養基、馬鈴薯-葡糖糖-瓊脂培養基(PDA培養基)和高鹽察氏培養基等。前兩種培養基在進行稻谷危害真菌計數時需添加氯霉素抑制細菌生長，但高鹽察氏培養基利用高滲環境抑制非真菌生長，三種培養基均可對霉菌和酵母計數，但PDA培養基也可用對純化霉菌的菌落和鏡檢形態學鑒定。目前，仍有科研人員研究培養基的配方及使用方法對霉菌監測準確性的影響。梁美丹等[31]發現孟加拉紅培養基和PDA培養基對霉菌、酵母菌計數結果差異不明顯，霉菌、酵母菌采用正置培養方式檢出率比倒置培養方式高。邵敏等[32]向孟加拉紅培養基中添加2.0%葡萄糖、0.15%吐溫20和0.25%磷酸二氫鉀進行改良，發現該改良培養基對常見食品中霉菌的檢出率較國標法孟加拉紅培養基平均高出59.6%。通過傳統平板培養法對霉菌進行計數及分離、鑒定屬于微生物分析中的經典方法，但該法耗時長(超過一周)，在稻谷霉變監測中往往無法提供及時的微生物數據，不能給突發狀況提供參考。

2.3 孢子計數法

為克服平板培養在稻谷霉菌監測中耗時過長的問題，程樹峰等[33]構建了適合于儲藏稻谷的危害真菌孢子計數法：稻谷樣品采用水提取后，通過濾網除去菌絲體，通過血球計數板計數；該法標準誤差范圍在12.2%～36.5%，并與平板計數法具有較好的相關性。唐芳等[34]采用真菌孢子計數法研究了水分和溫度與儲藏稻谷中真菌生長之間的關系，構建了真菌危害早期生長曲線，可預測高水分稻谷短期安全儲藏時限。姜洪等[35]對山東省3棟典型稻谷倉中真菌孢子的數量進行了跟蹤監測，發現三棟倉中均出現了霉菌孢子數接近或超過106的情況。

2.4 CO2濃度監測法

霉菌生長會產生CO2，造成霉變點CO2濃度升高。唐芳等[36]發現，儲藏稻谷中危害真菌數與CO2濃度具有良好的相關性，模擬儲藏溫度25 ℃和30 ℃下稻谷樣品真菌孢子數與CO2相關系數(R2)分別為0.959 1和0.943 9，實倉中糧堆和倉內環境下兩者的相關系數分別為0.998 4和0.988 7。唐芳等[37]研發出基于CO2的一種新型的儲糧生物危害早期檢測儀器，稻谷中CO2濃度與真菌數的相關系數達0.983 8。姜洪等[35]發現，稻谷倉中CO2濃度在熏蒸和通風換氣后下降，但真菌孢子一旦產生就一直會被檢出，因而研究團隊認為真菌孢子技術與糧堆CO2濃度之間的關系具有不確定性。目前，該法仍在技術理論積累階段，有待實際倉儲的推廣應用。

2.5 光譜技術

光譜技術具有操作方便、檢測速度快的特點，在糧食的成分分析中已有大量應用。近些年，有研究人員嘗試利用光譜技術對稻谷中的霉菌進行帶菌量分析及菌種鑒別。金昌福等[38]對儲藏稻谷近紅外光譜中12個波數的特征吸收值與表面霉菌總數進行了關聯。所構建的多元線性回歸模型相關性較好，R2值達0.943。Sirisomboon等[39]研究了近紅外光譜與總真菌、黃綠色曲霉的模型，對90份自然霉菌污染及16份人為霉菌污染的稻谷樣品的光譜進行相關分析，發現總霉菌量與原始光譜的相關系數r達0.668，黃綠色曲霉與最大歸一化光譜有一定的相關性(r=0.437)。Cong等[40]建立稻谷霉菌監測的高光譜無損監測方法，通過關聯光譜數據與霉菌量構建支持向量回歸模型，并通過灰狼優化算法對模型優化，發現模型對校正集和預測集擬合的相關系數分別為0.962 1和0.951 1。劉凌平等[41]利用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜技術對稻谷中尖孢鐮刀菌(Pr、Po和M23)、黃灰青霉Pe、擴展青霉3.789 8、灰綠曲霉3.397 5和亮白曲霉7種常見有害霉菌進行快速鑒定方法研究，發現通過主成分分析法可有效區分7種菌株，建立的線性判別分析和偏最小二乘判別分析模型對7種菌株的留一交互驗證整體正確率可達87.1%和87.3%。肖慧等[42]利用高光譜圖像技術對儲藏稻谷中5種真菌(黑曲霉、米曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、桔青霉)進行區分，對馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基培養真菌平板的高光譜圖像分析發現，譜圖波峰709 nm處光譜值擬合的生長模型(R2介于0.909 5～0.967 9)優于全波段光譜值主成分分析中第一主成分得分構建的生長模型(R2介于0.178 1～0.950 1)；主成分分析結合偏最小二乘法判別分析區分5種不同菌種效果良好，最小二乘法判別分析模型對雜色曲霉測試集區分準確率為33.33%外，對其他真菌及對照組的訓練集與測試集區分準確率均達100%。盡管光譜技術在稻谷霉菌快速檢測中表現出了相當的優勢，但欲在實際監測中應用仍需大量系統的研究。

2.6 其他方法

宋偉等[43]利用電子鼻對儲藏稻谷揮發性物質的敏感識別能力，在優化傳感器陣列后，通過數據訓練建立菌落與檢測器響應的最小二乘模型，數據驗證中發現該法具有一定可行性，但準確度不穩定，仍需進一步完善。

3 儲藏稻谷中真菌的防控方法

3.1 溫濕度控制

針對真菌對溫濕度敏感的特點，倉儲實踐中通過控制糧食儲藏水分、降低糧堆溫度等方式抑制真菌生長。田國軍等[44]發現，冬季通風降低稻谷水分和溫度后，霉菌含量降至入倉時的一半。高樹成等[45]在遼寧利用冬季自然低溫結合制冷設備6～10月降溫控制稻谷溫度，發現糧堆夏季溫度可控制在21 ℃以下，稻谷表面霉菌數量無明顯變化。在利用自然環境減少稻谷儲藏控溫能耗目前是一個熱點的研究領域，目前正在研發和推廣的技術包括熱泵技術、太陽能技術等[46-49]。

3.2 防霉劑處理

除依靠溫濕度控制真菌外，采用化學防霉劑可有效抑制霉菌生長。盛強等[50]研究了食品級雙乙酸鈉與山梨酸鉀復配(質量比4∶1)的復合型防霉劑在高水分稻谷中的抑菌效果，通過3種劑量(0.1%、0.2%和0.3%)應用效果的比較，發現防霉劑施加量越大，防霉效果越好，但效果也與稻谷含水率有關。陳麗麗等[51]研究了谷保防霉劑對稻谷霉菌的抑殺效果，發現劑量0.2%的谷保防霉劑對糧食表面霉菌的抑制率可達95.9%，而對內部霉菌抑殺作用不明顯，另外白曲霉對谷保防霉劑有較強的耐受能力。

為減少化學防霉劑的潛在危害，植物源活性成分對儲藏稻谷中真菌的抑菌及殺滅作用逐漸被科研人員重視。Paranagama等[52]研究了檸檬草精油對稻谷中提取的黃曲霉菌株的作用效果，發現該精油對所試菌株的抑菌和殺菌濃度分別為0.6和1.0 mg/mL，進一步研究發現其中活性成分為檸檬醛a和b，另外該檸檬精油熏蒸對所試菌株孢子形成和菌絲生長的抑制濃度分別為2.8和3.46 mg/mL。Reddy等[53]研究了一些植物提取物對稻谷中黃曲霉的抑菌作用，發現蒲桃提取物在5 g/kg下可以完全抑制黃曲霉的生長，而姜黃、洋蔥和圣羅勒等植物的抽提物在相同濃度下抑菌率在65%～78%。Cardiet等[54]比較了丁香精油、丁香油酚、香芹酚、異硫氰酸烯丙酯及甲酸乙酯對Aspergilluswesterdijkiae和禾谷鐮刀菌的抑菌作用，發現其中的異硫氰酸烯丙酯具有較好的抑菌和孢子殺滅能力，其對兩種微生物的最低抑菌濃度分別為24.2和19.8 μL/L。

3.3 臭氧處理

臭氧是一種強氧化劑，具有廣譜殺滅微生物作用。周建新等[55]儲前對稻谷進行臭氧處理，發現臭氧對稻谷霉菌具有顯著的殺滅作用，處理后的稻谷在儲藏初期霉菌含量出現反彈，但隨后的變化與溫度有關，儲藏溫度15和20 ℃下霉菌量基本穩定，而儲藏溫度25、30、35 ℃時霉菌量均表現出下降趨勢。Beber-Rodrigues等[56]發現稻谷自然污染的霉菌在臭氧處理后含量下降，主要霉菌種屬對臭氧的耐受性由高到低順序為：支頂孢屬>鏈格孢屬>出芽短梗霉>曲霉>青霉。臭氧不穩定，在空氣中的半衰期短，應用后無殘留，相對安全，其熏蒸技術是稻谷儲藏領域正在推廣的一種技術。Savi等[57]對鐮刀菌屬、青霉屬及曲霉屬的臭氧抑菌結果表明，60 μmol/mol的臭氧濃度可有效抑制真菌的生長，特別是對禾谷鐮刀菌和桔曲霉；臭氧可以抑制分生孢子萌發，造成菌絲形貌變化，從而導致菌絲體死亡及活性氧形成。

3.4 射線處理

在微生物領域，射線可以用來破壞微生物的菌體結構，導致菌體死亡。紫外線、紅外線、γ射線及微波射線均被證實可用于殺滅儲藏稻谷中的有害真菌。萬忠民等[58]研究了紫外線輻照控制稻谷霉菌的可行性及影響抑菌效果的因素，Box-Benhnken中心組合實驗的響應面實驗結果表明，影響因素由高到低為輻照功率、稻谷處理量、輻照時間，優化得到的輻照條件為輻照時間15.39 min、稻谷處理量74.7g/dm2、輻照功率136.30 W。Wang等[59]在新收獲稻谷和復水儲藏稻谷中接種黃曲霉后，采用紅外加熱及緩蘇處理，發現延長紅外處理和緩蘇時間均可增強抑菌效果，初始含水量27.0%的新收獲稻谷黃曲霉含量下降高達8.3 log，初始含水量19.4%復水稻谷中黃曲霉含量可達7.2 log。Maity等[60]采用60Co γ射線處理稻谷，發現稻谷中真菌量隨處理劑量和儲藏時間的延長下降，處理劑量2kGy下致死率達50%。Wang等[61]也發現，隨60Co γ射線處理劑量的增加，稻谷中檢出的四種主要曲霉(白曲霉、灰綠曲霉、黑曲霉和黃曲霉)的檢出率逐漸降低。Braghini等[62]采用稻谷中接種互隔交鏈孢霉的方法研究了60Co γ射線對該霉菌的抑制和殺滅效果，發現5 kGy的劑量可有效抑制菌體生長，完全抑制菌體增長的劑量需達到10 kGy。Fang等[63]采用低劑量微波對稻谷中分離的寄生曲霉進行處理，發現其可以增加菌體細胞膜通透性，增加菌體電解質、Ca2+、蛋白及DNA的滲漏，使菌絲體粗糙、溶脹；通過與傳統加熱對比發現，低劑量微波主要通過影響Ca2+透過性和DNA降解引起寄生曲霉死亡，而傳統加熱則主要通過增加電解質滲透性和DNA濃度的方式。

3.5 其他方法

詹耀等[64]研究了超高壓在亮白曲霉污染稻谷中的殺菌效果，發現壓力和保壓時間對稻谷亮白曲霉的殺菌作用影響顯著，壓力增大至300 MPa時致死效果明顯增強，保壓時間越長致死作用越好。Li等[65]通過將聚乙烯和高度分散的Ag/TiO2共混制備出一種納米薄膜，該薄膜相比普通PE袋抑制霉菌生長的效果顯著。

4 結論

作為儲備糧種，稻谷的儲藏安全關系國計民生。稻谷儲藏過程中，真菌活動會引起稻谷霉變、結塊，甚至帶毒。針對此，科研人員在稻谷中真菌的生長特性、監測及防控等方面進行了大量的研究，許多研究成果已經應用于稻谷的儲藏實踐中，以科學合理地解決儲藏稻谷中真菌的潛在危害。還有許多問題需進一步深入研究，如稻谷儲藏過程中不同真菌活動的相互影響、真菌與其他微生物之間的相互作用、糧倉環境中濕熱分布對真菌活動的影響、儲藏稻谷中真菌的快速分析方法、防霉劑的開發與有效施用技術等。對儲藏稻谷中真菌的系統研究，可推動糧食儲藏真菌的研究向更深入、全面方向發展，具有重要的學術意義，同時可豐富糧食真菌的防控方法庫，為糧食行業的健康穩定發展做出貢獻。