煙草黑脛病抗性鑒定研究現狀與展望

方敦煌，肖炳光，焦芳嬋，曾建敏，吳興富

云南省煙草農業科學研究院，云南昆明 650021

煙草黑脛病（tobacco black shank）是由卵菌Phytophthorɑ nicotiɑnɑe引起的土傳病害，在溫帶、亞熱帶和熱帶發生程度較重，是我國煙草的第二大病害[1-2]。已有研究表明，最經濟有效的防治措施是選育和應用抗病品種。國外抗黑脛病育種始于20世紀20年代，在育種過程中發現Florida 301和Beinhart 1000-1是黑脛病的抗源[3]，由于黑脛病危害的逐年增加，研究人員規模化開展了抗源的篩選，將抗黑脛病較好的野生種N. plumbɑginifoliɑ、N. longi florɑ、N.stocktonii、N. nesophilɑ和N. repɑndɑ中的抗性轉育至普通栽培煙草[4-6]，漸漸形成Florida 301、Beinhart 1000-1、Coker 371-Gold、N. plumbɑginifoliɑ和N. longi florɑ等5大抗源育種體系[3]。我國從20世紀50年代開展抗黑脛病育種以來，不懈探索抗性鑒定方法，持續開展煙草種質資源與新品種（系）的抗病鑒定工作，但在抗源利用、抗性鑒定技術、工作程序上還有待進一步改進完善。本文在梳理國內外有關文獻的基礎上，結合自身工作實踐，對煙草黑脛病的抗性鑒定研究現狀進行了總結與展望。

1 抗性鑒定方法研究進展

煙草黑脛病菌主要集中在0～5 cm的土層活動，對煙草的田間侵染發生于近地表的根及莖基部，偶爾由帶菌雨水飛濺侵染葉片[1-2]。煙草黑脛病的抗性鑒定是一個依據侵染特性接種病菌、觀察病癥反應并評價的過程，按接種部位分為根部、莖部和葉部接種等3種方法[4-11]；按鑒定時期劃分為苗期和成株期2種方法；近年來，出現了針對特定抗源開發的分子標記輔助抗性鑒定方法。為了與現行的煙草品種抗病性鑒定標準[12]一致，本文按鑒定時期論述煙草黑脛病抗性鑒定方法。

1.1 苗期鑒定

苗期接種方法較多[13]，用于抗性鑒定的可歸納為菌絲塊創傷莖/根接種法（菌谷法）、游動孢子或菌絲體懸浮液莖注射接種法[14]（注射法）、游動孢子懸浮液浸根接種法（游動孢子浸根法）、毒素脅迫種子萌發法[15]（毒素法）等4種方法。注射法由于操作比較繁瑣、費時，難以實現苗期抗性鑒定的規模化。因此，本文重點評述菌谷法、游動孢子浸根法和毒素法3種抗性鑒定方法進展。

1.1.1 菌谷法

菌谷法于20世紀80年代初提出[16]，被煙草品種抗病性鑒定標準[12]采用，并規范了抗感對照品種、菌谷接種量、病害誘發條件、病害調查方法和調查時間[17]。在實際應用中，菌谷法不斷改進。云南省煙草科學研究所[18]優化了抗性指標，將菌谷埋入煙苗莖基部接種后以第5 d、7 d和10 d共 3次病情指數的平均值作為測試品種的抗性指標。貴州省煙草科學研究院[19]將菌谷埋入煙苗根部接種后3～10 d調查病情，評價抗性，大大減少了工作量。河南省農業科學院煙草研究所[20]在病菌菌絲平板上點播表面消毒的煙草種子，對萌發的種子進行發病率統計、抗感水平評價，大幅度縮短了鑒定時間。

此外，菌谷法還衍生出另一種方法——莖基部創傷菌絲塊貼接法[21]。該方法接種時菌絲塊須準確貼接在創傷傷口上，在確保人工創傷傷口大小一致[21-22]、定量菌絲塊貼接與保濕一步到位[23]的前提下，可進行規模化篩選和驗證[24]。

1.1.2 游動孢子浸根法

游動孢子浸根法由Gooding等[25]提出，Stokes等[26]將其用于煙草品種抗性鑒定，Jaarsveld等[11]將其進一步發展為煙草品種抗性鑒定方法，梁元存等[27]驗證其鑒定結果可靠。但以上研究在接種前需要洗凈煙草幼苗根部，對煙苗根系造成較大的傷害，接種時煙苗根部接觸游動孢子的表面積大，選擇壓力過大，存在發病偏重、中抗材料易被歸入感病類型等問題。云南省煙草農業科學研究院[28]對此進行了改進，采用兩段式漂浮育苗方式[29]培育煙苗，刮根、淺盤定量浸根接種，根系創傷適中、接種量均一化、中感與中抗易于區分，而且鑒定對象規模化，有效提高了鑒定的規模和效率。

1.1.3 毒素法

毒素法是根據寄主植物對毒素和病害反應的一致性原理，用毒素代替病原物對植物品種個體、器官、細胞團和原生質體進行抗性篩選的方法，可以加速抗病育種進程[30]。煙草黑脛病菌產生的毒素[31]可以作為選擇壓篩選突變體[32-33]或評價抗性[34]。中國農業科學院煙草研究所[15]采用毒素液浸種，統計種子發芽率評價抗性，但尚需對毒素進行定量化、優化[35]才可高通量、快速鑒定煙草黑脛病抗性。毒素法較其他方法技術要求更高、環境條件更苛刻、操作難度大，建議作為輔助抗性鑒定方法。

1.2 成株期鑒定

成株期鑒定[12]主要在自然或人工病圃中進行。自然病圃的初侵染源來自連作煙田的煙草黑脛病病株，而人工病圃的初侵染源主要是人工添加的煙草黑脛病菌谷物培養物（即菌谷），兩者均可通過灌溉維持土壤含水量的飽和狀態以誘發病害。按煙草病蟲害分級及調查方法[17]規定，于發病初期、盛期、末期各調查1次，以感病對照品種病情指數最先達到60及以上的調查數據為依據進行抗病性評價，感病對照品種病情指數不低于60時試驗及評價有效。

成株期鑒定反映了品種的實際抗性水平，是品種推廣應用必需經過的階段。在應用標準方法進行成株期鑒定時，技術細節不斷得到充實。云南省煙草農業科學研究院明確了自然病圃選擇的條件[36]，并對接種方法進行了改進，采用層餅式接種覆蓋形成人工病圃、間歇式保濕誘發病害，避免了環境條件對鑒定結果的影響，提高了抗性鑒定的準確性與重現性[37]。

1.3 分子標記輔助抗性鑒定

分子標記輔助抗性鑒定法不需生物接種，可直接用于育種材料的抗性鑒定，但前提是抗源的遺傳特性明確。遺傳分析表明，N. plumbɑginifoliɑ、Coker 371-Gold和N. longi florɑ的抗性為顯性單基因控制，Florida 301、Beinhart 1000-1的抗性由微效多基因控制[38-40]。Johnson等在探索Coker 371-Gold的黑脛病抗性基因來源時，鑒定出6個與黑脛病抗性連鎖的RAPD標記[41]，并證明其可用于分子標記輔助抗性鑒定[42]。何彬等[43]研究表明31份表型鑒定為抗性的材料中，14份含有抗性RAPD，占比45.16%，說明抗性材料的抗病基因來源比較集中。高亭亭等[44]從Beinhart 1000-1中篩選到5個與黑脛病抗性緊密相關的QTLs，陳迪文等[45]利用白肋煙抗黑脛病品種B37檢測到7個黑脛病抗性相關QTLs，這些研究結果為精細定位抗病QTL奠定了基礎，推動了微效多基因控制的煙草黑脛病分子標記輔助選擇。

2 種質資源與新品種（系）的抗病鑒定

20世紀80年代以來，我國對煙草品種抗黑脛病鑒定方法與抗性指標進行了探索[16]，1996年在參考國內外煙草及其他作物品種抗病鑒定方法的基礎上，借助多年的實踐，制訂形成了包括煙草黑脛病在內的4種病害抗性鑒定行業標準[46]，2008年修訂、提升為國家標準[12]。同時，利用行業品種區域試驗平臺，形成了南北育種中心為主的煙草品種區域試驗網絡[47]，并對黑脛病抗性品種審定提出了明確要求[48]，煙草品種黑脛病抗性鑒定工作由專門的鑒定單位規范進行。

2.1 種質資源的抗病性

為搜集和尋找煙草黑脛病抗源，20世紀80年代我國重點開展了品種資源的收集整理，中國農業科學院煙草研究所對1000多份煙草資源進行反復驗證，篩選出高抗黑脛病0號生理小種的資源20多份，約占1.33 %，抗病材料125份，占比8.33 %[1]。

南方育種中心自成立以來在行業品種區域試驗平臺上持續開展黑脛病抗性鑒定。許美玲等[49]采用大田病圃人工接種0號生理小種菌谷對213份資源進行抗病鑒定，發現高抗品種17份、占7.98 %，中抗品種60份、占28.17 %，抗病品種48份、占22.54 %。黃成江等[50]采用菌絲塊創傷莖基部接種0號生理小種，在病圃測定了52份烤煙品種的抗性，結果表明高、中抗品種占30.78 %。李梅云等[51]采用苗期菌谷接種0號生理小種對146份煙草種質開展抗性鑒定與評價，結果表明抗性種質有118份，占比80.82 %。于海芹等[52]采用0號生理小種游動孢子浸根法對新引進的288份煙草種質進行了抗性鑒定，篩選出17份抗病資源和23份中抗資源。何彬等[53]對66份煙屬野生種的黑脛病（0號及1號生理小種）抗性進行了評價，篩選出14份抗0號生理小種、15份抗1號生理小種、11份資源兼抗0號和1號生理小種。

此外，研究人員在河南、湖南、貴州等黑脛病常發區開展了種質資源抗性鑒定。劉風蘭等[54]通過人工病圃鑒定，從26份材料中篩選出5份高抗資源、13份抗病資源。李艷[55]采用苗期菌谷法對26份曬煙資源進行了抗性測定，發現13份抗病資源、3份中抗資源。向世鵬等[56]采用人工病圃接種1號生理小種，對49份種質資源進行了抗病性鑒定，結果表明24份材料表現為抗病、7份材料表現為中抗。

2.2 新品種（系）的抗病鑒定

隨著黑脛病抗性鑒定技術的成熟，抗黑脛病育種取得了顯著成效，育成的抗病品種比例大幅度提高[57-59]，引進的抗病品種有K326[60]和NC89[61]，育成的抗病或中抗品種有云煙85[62]、云煙87[63]、中煙100[64]、龍江911[65]、云煙97[66]、南江3號[67]、云煙100[68]、秦煙96[69]等，均已先后成為烤煙主栽品種，累計種植面積均已超過100000 hm2[70]。

3 問題與展望

3.1 抗源利用不足，抗性和品質難以兼顧

煙草生產上應用最廣泛的抗源來自N. plumbɑginifoliɑ和 Florida 301。我國 抗黑脛病育種主體親本G28、K326、NC82的抗源來自Florida 301，缺乏來自N. plumbɑginifoliɑ的抗源[71]。雖然我國現存的煙草品種資源達到4312份[72]，但對黑脛病的抗性鑒定不夠，缺乏抗性、品質遺傳等方面的深入研究，抗性和品質難以兼顧。需要規模化篩選抗源、分析遺傳規律、挖掘抗病基因、篩選抗性分子標記，采取遠緣雜交、生物技術等多種方法創新抗源，通過復式雜交、修飾回交、混交-混選等育種體系，實現抗性和品質的同步改良。

3.2 鑒定方法的技術細節需進一步明確

國家標準方法[12]中，成株期鑒定涉及自然病圃與人工病圃。人工病圃與自然病圃相比，能夠較好地控制病菌的小種類型、致病力、數量和分布，且條件更優越，可保證病圃發病適中，準確性、重復性更好，建議在評價抗性時，以人工病圃鑒定為判別依據、自然病圃鑒定為參考。這種觀點已被煙草品種農業試驗技術規程[47]所采用。

國家標準方法[12]中，菌谷法技術有待完善。菌谷有根部、莖基部以及根部和莖基部同時接種3種方式。田間黑脛病調查時發現，成株期的莖基部是病菌最易受攻擊的部位、顯癥比根部快、病癥類型占絕對優勢[1,73]，且莖基部接觸病菌時間長，在整個生長季都存在侵染的可能；而根部侵染主要發生在苗期、大田早期，地上部癥狀不明顯或者不表現癥狀。因此，實際操作中可以莖基部接種為主，根部以及根部和莖基部同時接種為輔。此外，游動孢子浸根法可作為標準的補充方法，毒素法可作為標準的輔助方法。

國家標準方法[12]采用了抗、中抗、感病對照，增加了鑒定結果的縱向和橫向可比性，但沒有兼顧抗、中抗品種對照，抗病評價指標過于瑣碎，不便于國家標準與行業標準的銜接。建議在病害調查時，關注抗、中抗、感病3個對照品種的發病進程，按行業標準的病情指數指標評價抗性，以“感病對照品種病情指數不低于75、抗和中抗對照符合抗性評價指標”作為試驗及評價有效的判別依據。若感病對照品種病情指數介于50～75時，可借鑒棉花黃萎病的相對抗病指數[74-75]進行評價。當感病對照品種病情指數低于50時，試驗及評價無效。

3.3 鑒定工作程序尚需完善

在煙草黑脛病抗性鑒定的工作中，有必要探索不同方法鑒定結果的可比性[35]、苗期與成株期鑒定的相關性。由于不同煙草品種的耐病性和恢復力不同、以及組織器官的差異[73]，一些品種苗期和成株期抗病結果不一致，因此苗期鑒定適合于大批煙草種質和新品種（系）的抗性檢測篩查。對于即將推廣種植的重點材料仍應進行成株期鑒定，經苗期篩選出的抗性材料和品種（系），需經過成株期至少2點、2年的人工病圃鑒定，再進行品種審定和大面積推廣。

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