水稻葉片氣孔對CO2濃度變化的響應

卞景陽+張志剛+孫興榮+劉洋+齊國超+李澤宇

摘要：氣孔是植物與外界氣體交換的通道，CO2濃度發生變化，氣孔將第一時間作出響應。試驗以開頂式氣室（OTC）為研究手段，設定CO2濃度分別為380 μmol/mol（CK）、550 μmol/mol（處理），通過掃描電鏡觀察水稻第4張葉片的氣孔，分析CO2濃度增高對葉片氣孔分布和形態特征的影響。結果表明，處理較CK腹面、背面氣孔帶間距離增加24.27%、26.41%，氣孔帶上氣孔間距離縮小20.28%、14.73%，CO2濃度增加使氣孔帶上氣孔排列更加緊密；處理較CK葉片背面氣孔器面積、周長、長度顯著增加，葉片腹面寬度顯著減少；葉片背面保衛細胞的面積、周長、長度顯著增加，寬度顯著減少；葉片腹面氣孔乳突面積、周長顯著減少，背面乳突數量顯著減少；CO2濃度增加促進了葉片表面細胞分裂，增加了單位面積的細胞數量，促進細胞分裂，處理較CK腹面、背面氣孔指數（SI）分別下降14.80%、14.18%，氣孔密度（SD）變化差異不顯著，說明SI比SD更適合表達CO2濃度變化對氣孔的影響。

關鍵詞：CO2濃度；氣孔細胞；氣孔器；氣孔指數；形態特征

中圖分類號： S511.01文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）23-0072-04

葉片氣孔是植物與外界進行氣體交換的通道，CO2是光合作用的底物，大氣CO2濃度發生變化，氣孔將第一時間作出響應。學者對葉片氣孔對環境響應做了大量的研究，通過對氣孔參數與古氣候、古環境的研究，利用氣孔密度（SD）、氣孔指數（SI）與CO2濃度變化成反比這一特點，把氣孔參數（SD、SI）作為成為推測地質歷史時期大氣CO2濃度變化的重要古生物指標之一[3-4]。大多數研究表明，氣孔開度[5-6]、氣孔指數[7-8]與CO2濃度成反比，氣孔為了保持胞間CO2分壓始終低于大氣CO2分壓，葉片氣孔采取關閉氣孔和減少單位細胞內的氣孔數量（氣孔指數）對高濃度CO2的響應。但也有人對于SD與CO2濃度關系的研究結果存在一定的爭議。

東北粳稻具有獨特的粳稻血緣，在東北特殊的寒地氣候條件下，全球大氣CO2濃度增加將會對東北粳稻產生多大的影響，氣孔作為CO2與植物連接的通道，對CO2濃度增加如何響應，目前少見報道。本試驗以東北粳稻為研究材料，以21世紀中葉可能達到的CO2濃度（550 μmol/mol）作為模擬環境，在CO2濃度增加條件下，氣孔在葉片的分布（氣孔形態、SI、SD）進行分析，闡明水稻葉片氣孔到21世紀中葉葉片氣孔可能產生的變化。并系統分析了氣孔特征（長、寬、面積、周長）、氣孔細胞（保衛細胞、乳突）特征、氣孔參數在CO2濃度變化環境下的變化規律和趨勢。

1材料與方法

1.1供試材料

粳稻品種為東農428。

1.2試驗設計

試驗于2012年在黑龍江省農業科學院農業示范園區（125°42′E、44°04′N）進行，土壤為東北黑土，攪拌均勻，未施用肥料，CO2濃度分別設置為380 μmol/mol（CK）和 550 μmol/mol（處理）2個處理，3次重復，采用開頂式氣室（OTC）CO2富集系統。試驗在OTC內進行，于4月17日播種，第4張葉完全展開時取樣，并電鏡觀察。本試驗使用的裝置OTC是八角形狀——OTC-1型，通氣后OTC內CO2分布均勻，試驗處理濃度的設定以工業革命時期CO2濃度為基準加倍。試驗從播種開始進行CO2濃度處理直到水稻第4張葉完全展開結束。

1.3掃描電鏡制樣

在水稻葉片中部中脈附近，取寬度約1.5 mm切片，經戊二醛固定、緩沖液沖洗、乙醇系列脫水、叔丁醇置換、ES-2030型（HITACHI）冷凍干燥儀干燥，粘樣、E-1010型（HITACHI）離子濺射鍍膜儀鍍金膜，置于S-3400N型（HITACHI）掃描電鏡下觀察。

1.4掃描電鏡觀察

利用OLYMPUS TEM Lmaging Platform軟件觀察，測定葉片表面氣孔細胞的形態特征。每個處理制定3個臨時裝片，于300、1 000倍電鏡下拍照觀測葉片表面氣孔，選擇清晰的圖片測定氣孔細胞形態特征。氣孔寬度為垂直于主葉脈的氣孔最大值，氣孔長度為平行于主葉脈的氣孔最大值。測量數據通過使用OLYMPUS TEM Lmaging Platform軟件自動生成，保證數據的準確性。

1.5數據處理

試驗數據利用Office軟件進行數據整理，采用IBM SPSS Statistics 19軟件對數據進行分析作圖和差異性比較。氣孔指數計算公式為I=S/（S+E），式中I為氣孔指數，S為單位面積的氣孔數目，E為單位面積的表皮細胞數目。

2結果與分析

2.1CO2濃度變化對水稻葉片氣孔帶形態結構的影響

電鏡觀察（圖1）顯示，氣孔器由1對保衛細胞和外面包裹著近似菱形的副衛細胞組成，副衛細胞上分布著4～5個乳突。2個硅栓細胞帶中間平行排列著2列氣孔帶。氣孔帶分布較均勻，一般呈直線形和S形排列。

CO2濃度變化，葉片表面（腹面、背面）氣孔帶中，氣孔排列和氣孔之間的距離發生相應變化。2個氣孔間垂直距離比較可知，CK、處理分別是（65.81±1.11）、（46.32±0.84） μm，氣孔之間的距離隨CO2濃度增加呈縮小趨勢，并達到顯著水平。氣孔帶間距離隨著CO2濃度增加有加大趨勢，并在腹面、背面均達到極顯著水平（圖2）。

掃描電鏡觀察結果顯示，葉片氣孔的排列主要有直線和S型排列2種，高濃度與CK比較，氣孔排列方式變化特征明顯，由于高濃度CO2使得氣孔間距離縮小，氣孔帶間距離加大，使得每列氣孔排列更加緊密，并導致氣孔帶橫向發展，最后導致S型排列氣孔帶數量增加。

2.2CO2濃度變化對水稻葉片表面氣孔器特征參數的影響endprint

由表1可知，葉片腹面和背面的氣孔對CO2濃度變化的響應存在一定的差異。對于葉片腹面，氣孔寬度發生變化，呈現CO2濃度增加氣孔寬度變小的趨勢，并達到顯著水平。CO2濃度增加使葉片背面氣孔面積、周長、長度顯著增加。

2.3CO2濃度變化對水稻氣孔保衛細胞特征參數的影響

保衛細胞是氣孔器上最重要的細胞，控制著氣孔開合，保衛細胞也是對CO2濃度反應最靈敏的細胞。一般來說，CO2濃度增加，保衛細胞pH值降低，水勢升高，水分排出，氣孔開度變小。保衛細胞對CO2濃度變化的響應與整個氣孔器的變化趨勢基本一致，保衛細胞背面面積、周長增加，長寬比變大，腹面影響差異不顯著（表2）。

2.4CO2濃度變化對水稻氣孔乳突細胞特征參數的影響

氣孔乳突也是反映氣孔特征的重要細胞，特別是在不同類型的水稻上，氣孔乳突差異很大，與水稻育種和起源有著密切的關系。由表3可知，CO2濃度變化對氣孔乳突產生顯著影響，處理對乳突面積、周長、數量有減少趨勢，并達到顯著水平；使乳突高度顯著增加。

CO2濃度變化對葉片腹面和背面的SI產生顯著影響，處理使葉片SI下降，并達到極顯著水平（圖3）。同一葉片氣孔密度無明顯差異，處理使得單位面積細胞數量顯著增加，造成

SI顯著下降。

3討論

植物氣孔形態受環境和遺傳因素的綜合影響，在同一遺傳背景的情況下研究植物氣孔形態性狀對氣候因素的響應。人們對CO2濃度對植物氣孔的影響做了大量的研究，在探索氣孔對CO2濃度變化的響應方面，利用氣孔參數與CO2濃度之間關系把氣孔參數設定為植物考古和氣孔進化的重要指標之一。目前從學者對氣孔參數與CO2關系的研究中顯示，不同植物SD對CO2響應存在一定的差異[9-20]，主要結論有隨著CO2濃度增加，SD顯著下降或影響不顯著或略有增加。Beerling等研究發現，常春藤、吊蘭等植物的SD和SI與CO2濃度呈負相關關系[21]。Kouwenberg等研究了新西蘭不同海拔段分布的黑假水青岡，發現其SD與CO2濃度呈負相關關系[22]。Franks等利用不同地質時代相同或近緣的植物化石，在更大尺度上研究植物葉形態特征對氣候變化的響應，對不同地質時期同一類群植物的氣孔大小、氣孔密度與大氣CO2濃度的相互關系進行研究，他們認為隨著大氣CO2濃度增加，植物葉片的氣孔密度在逐步減少[23]。

有些植物對CO2濃度變化響應不明顯。例如，CO2濃度增高，黑麥草[24]的SD對CO2濃度變化的反映不明顯；楊松濤等對C3作物近軸面上SD研究發現有一定的下降趨勢，其中水稻有上升趨勢，但差異不明顯[9]。齊淑艷等研究牛膝菊氣孔形態表明，SD略有上升，但差異不明顯[11]。Woodward等在研究高山植物時發現，隨著海拔升高，CO2濃度增高，有6種植物SD減少，而歐亞械、夏櫟、藥鼠李3種植物葉片近軸面SD不受影響[17]。而有些植物與CO2濃度呈現正相關關系，例如百脈根近軸面和遠軸面的SD增加[14]；Zhou等的研究則表明，黃背櫟的氣孔參數與大氣CO2濃度呈正相關關系[25-26]。本試驗結果顯示，水稻的SD隨CO2濃度變化差異不顯著，結果與部分C3植物對CO2濃度變化的響應相似。

相關結果表明，不同物種的SD、SI對CO2濃度的變化響應存在較大的差異，具有高度的種間特異性。Royer總結了發表的176種C3植物的數據，綜合分析發現，試驗條件、辣葉標本、植物化石3種方式下，CO2濃度增加，SD下降的比例分別為40%、50%、88%，而所有植物中，SD增加比例不超過12%[27]。Haworth等對柏科6種植物的臘葉標本的SI與CO2濃度的關系進行研究，發現其中3種（Tetraclinis articulate、Callitris columnaris、Callitris rhomboidea）表現出顯著負相關關系，另外3種（Athrotaxis cupressoides、C. preissii、C. oblonga）無相關性[28]。而且Callitris的4種植物反應并不一致，反映了SI與CO2濃度的關系的高度種間特異性。

植物氣孔對不同氣候條件有著不同的響應，CO2和光照條件主要影響氣孔的發生，而溫度、水分等其他因素主要影響葉片表皮細胞的大小。SD與溫度、水分存在著相關性[29-30]，Luomala等發現，歐洲赤松氣孔發生對CO2不敏感，而溫度升高，氣孔密度明顯下降[31]。相比之下，SI更加穩定[8，18，32]，SI消除了部分非CO2因素帶來的影響，更能反映氣孔對CO2的響應。本試驗結果也證明這一點，葉片腹面、背面的SD對CO2濃度的響應，差異不顯著，SI充分反映出腹面與背面氣孔對CO2響應，均顯著下降。在SD差異不顯著、而SI顯著下降情況下，說明CO2濃度增加，促進了細胞分裂，增加了單位面積的細胞數量，促進細胞分裂，結論與楊松濤等的結果[9]一致。

CO2濃度增加，氣孔面積增加，氣孔的開閉主要由保衛細胞和副衛細胞完成，氣孔面積的增加可能是氣孔細胞對CO2濃度變化的一種適應性變化。有研究表明，在光照和黑暗條件下，氣孔開度都隨CO2濃度的升高而減少。抑制機理可能是保衛細胞pH值下降、水勢上升、保衛細胞失水，促使氣孔迅速關閉。

許多研究表明，氣孔面積、周長、長度、寬度均隨CO2濃度增加而增加[11，33]。本試驗結果顯示，水稻葉片氣孔隨CO2濃度增加，氣孔面積、周長、長度均呈增加趨勢，并達到顯著水平；氣孔寬度顯著下降。

對于葉片腹面與背面形態結構對CO2的響應，許多研究表明背面比腹面更加穩定[7-8，34-36]，也有試驗發現背面對CO2濃度具有一定的敏感性，林金星等對大豆葉片研究顯示，CO2濃度增加使葉片背面覆蓋有大量的星狀表面角質蠟層，而腹面卻沒有變化[12]。本試驗結果顯示，腹面氣孔參數（SD、SI）對CO2響應大于背面，腹面、背面SD影響不顯著，腹面SI下降19.97%，背面下降16.52%。氣孔面積、周長、長度變化，來自于背面，氣孔寬度變化來自于腹面。endprint

CO2濃度增加，葉片氣孔采取關閉氣孔和減少單位細胞內的氣孔數量（SI）對高濃度CO2的響應。但是結果中SI下降并不代表單位面積氣孔數量的減少，很可能是由于表皮細胞數量的增加，同時相關研究表明，CO2濃度增加使單葉葉面積減少。說明長期CO2濃度增加，葉片不僅是減少單位細胞內的氣孔數量，還在一定程度上減少單葉葉面積。

植物在自然條件下受多種因素的影響，同時在環境變化的情況下，不同植物自身的調節能力各不相同[37-38]。野生植物經過長期的自然環境選擇，具有很強的適應性，相對于野生植物而言，栽培植物對環境變化更加敏感，葉片氣孔在受多種氣侯因素的影響時表現出的特征將會產生很大的變數。研究CO2濃度與氣孔特征和參數，闡明氣孔變化響應的機理，特別是存在爭議的一些氣孔特性，還須要今后在自然條件下的長期觀察和更多模擬試驗。

參考文獻：

[1]IPCC. Climate change 2007：the physical science basis[M]//Solomon S，Qin D，Manning M，et al. Contribution of working group Ⅰ to the fourth annual assessment report of the intergovernmental panel on climate change. Cambridge：Cambridge University Press，2007：996.

[2]IRRI. Rice almanac：source book for the most important economic activity on Earth[M]. Oxon：CABI Publishing，2002.

[3]Beerlling D J，Royer D L.Reading a CO2 signal from fossil stom ata[J]. New Phytol，2002，153（3）：387-397.

[4]Retallack G J. A 300-million-year record of atmospheric carbon dioxide from fossil plant cuticles[J]. Nature，2001，411（6835）：287-290.

[5]孫同興，張昕，張長勝，等. CO2倍增對紫花苜蓿葉片形態結構的影響[J]. 萊陽農學院學報，1999，16（1）：1-5.

[6]張昕，張秀芬，鞠賦紅. 大氣CO2濃度升高對植物形態結構的影響[J]. 萊陽農學院學報，1997，14（1）：36-41.

[7]馬清溫，李鳳蘭，李承森. 氣孔參數的變異系數和影響因素[J]. 北京林業大學學報，2005，27（1）：19-23.

[8]馬清溫，李鳳蘭，李承森. 氣孔參數與大氣CO2濃度的相關性及其影響因素[J]. 西北植物學報，2004，24（11）：2020-2024.

[9]楊松濤，李彥舫，胡玉熹，等. CO2濃度倍增對10種禾本科植物葉片形態結構的影響[J]. 植物學報，1997，39（9）：859-866.

[10]高素華，郭建平，毛飛，等. CO2濃度升高對植物種子萌發及葉片的影響[J]. 資源科學，2000，22（6）：18-21.

[11]齊淑艷，郭曉華，趙明. CO2與O3濃度升高對入侵植物牛膝菊葉片形態特征的影響[J]. 東北師大學報（自然科學版），2009，41（2）：149-153.

[12]林金星，胡玉熹. 大豆葉片結構對CO2濃度升高的反應[J]. 植物學報，1996，38（1）：31-34.

[13]劉發民，王利榮，李怡，等. 大氣CO2濃度升高對木本植物影響的研究進展[J]. 安徽農業科學，2008，36（28）：12182-12185.

[14]Ferris R，Taylor G. Stomatal characteristics of four native herbs following exposure to elevated CO2[J]. Annuals of Botany，1994，73（4）：447-453.

[15]Madsen，E. Effect of CO2 concentrantion on growth and fruit production of tomato plant[J]. Acta Agric Scand，1974，24（3）：242-246.

[16]Ryle G J A，Stanley J. Effects of elevated CO2 on stomatal size and distribution in perennial ryegrass[J]. Ann Bot，1992，69（6）：563-565.

[17]Woodward F I，Bazzaz F A. The responses of stomatal density to CO2 partial pressure[J]. Journal of Experimental Botany，1988，39（12）：1771-1781.

[18]楊惠敏，王根軒. 干旱和CO2濃度升高對干旱區春小麥氣孔密度及分布的影響[J]. 植物生態學報，2001，25（3）：312-316.

[19]Knapp A K，Cocke M，Hamerlynck E P，et al. Effect of elevated CO2 on density and distribution in a C4 grass and a C3 forb under field condit ions[J]. Annales of Botany，1994，74（6）：595-599.endprint

[20]Gray J E，Holroyd G H，VanderLee F M V D，et al. The HIC signaling pathway links CO2 perception to stomatal development[J]. Nature，2000，408（6813）：713-716.

[21]Beerling D J，Woodward F I. Stomatal responses of variegated leaves to CO2 enrichment[J]. Ann Bot，1995，75（5）：507-511.

[22]Kouwenberg L L R，Kurschner W M，Mcelwain J C. Stomatal frequency change over altitudinal gradients：prospects for paleoaltimetry[J]. Rev Mineral Geochem，2007，66（1）：215-241.

[23]Franks P J，Beerling D J. Maximum leaf conductance driven by CO2 effects on stomatal size and density over geologic time[J]. Proc Nat Acad Sci USA，2009，106（25）：10343-10347.

[24]Ryle G J A，Stanley J. Effect of elevated CO2 on stomatal size and distribution in perennial ryegrass[J]. Annuals of Botany，1992，69（6）：563-565.

[25]Zhou Z K，Hu J J，Su T，et al. Changes in stomatal frequency in two oaks along an elevation gradient in the Himalayas[C]. ⅩⅧ International Botanical Congress，Melbourne Australia，2011.

[26]Hu J J，Zhou Z K. The relationship between stomatal frequency and atmospheric p CO2 of Quercus pannosa and its application to paleoelevation reconstruction[J]. IPC/IOPC，2012，2012（58）：91-92.

[27]Royer D L. Stomatal density and stomatal index as indicators of paleoatmospheric CO2 concentration[J]. Rev Palaeobot Palynol，2001，114（1/2）：1-28.

[28]Haworth M，Heath J，Mcelwain J C. Differences in the response sensitivity of stomatal index to atmospheric CO2 among four genera of Cupressaceae conifers[J]. Annals of Botany，2010，105（3）：411-418.

[29]Ticha I. Photos ynthetic characterist ics during on togenesis of leaves. 7. Stomata density and sizes[J]. Photosy nthetica，1982（16）：375-471.

[30]Reddy K R，Robana R R，Hodges H F，et al.Int eractions of CO2 enrichment and temperature on cotton growth and leaf characteristics[J]. Environ Exp Bot，1998，39（2）：117-129.

[31]Luomala E M，Laitinen K，Sutinen S，et al.Stomatal density，anatomy and nutrient concentrations of Scots pine needles are affectedby elevated CO2 and temperature[J]. Plant Cell and Environment，2005，28（6）：733-749.

[32]左聞韻，賀金生，韓梅，等. 植物氣孔對大氣CO2濃度和溫度升高的反應——基于在CO2濃度和溫度梯度中生長的10種植物的觀測[J]. 生態學報，2005，25（3）：565-574.

[33]徐文鐸，齊淑艷，何興元，等. 大氣中CO2、O3濃度升高對銀杏成年葉片氣孔數量特征的影響[J]. 生態學雜志，2008，27（7）：1059-1063.

[34]Rowson J M. The significance of stomatal index as a differential character.Part Ⅲ. Studies in the genera Atropa，Datura，Digitalis，Phytolacca and in polyploid leaves[J]. Quarterly J Pharm Pharmaceut，1946，19（1）：136-143.

[35]Sharma G K，Dunn D B. Effect of environment on the cuticular features in Kalanchoe f edschenkoi[J]. Bull Torrey Bot Club，1968，95（5）：464-473.

[36]Sharma G K，Dunn D B. Environmental modifications of leaf surface traits in Datura stramonium[J]. Can J Bot，1969，47（8）：1211-1216.

[37]劉廣志，陳炳佑，侍福梅. MAP18參與了脫落酸調控的擬南芥氣孔關閉及根生長[J]. 江蘇農業科學，2015，43（11）：55-57.

[38]韓磊，孫兆軍，焦炳忠. 水分脅迫下檸條葉片氣孔導度對環境因子的響應[J]. 江蘇農業科學，2016，44（10）：265-268.江蘇農業科學2017年第45卷第23期孟自力，王和洲，閆向泉，等. 施氮量對小麥商麥156光合特性、冠層光截獲及產量的影響[J]. 江蘇農業科學，2017，45（23）：76-79.endprint