基于毒性視角考察水飛雄黃的質量情況及其影響因素

姜臘+徐煥華+江珍紅+楊詩涵+史巧莉+馬增春+高月+陳志武

[摘要] 對收集到的市售3個生產廠家的水飛雄黃采用HPLC-ICP-MS分析其砷的形態及不同形態砷的含量。結果發現，3家企業游離As（Ⅲ）均未超過藥典限值，但按游離砷[As（Ⅲ）+As（Ⅴ）]的總值計算，1家企業超出藥典限值。現有藥典游離砷檢定方法為古蔡氏檢砷法，存在一定局限性，未能有效規避三價砷以外的其余價態砷伴生的毒性風險。隨后考察了水分和溫度對水飛雄黃中可溶性砷的含量及形態的影響。結果表明：①水分對水飛雄黃中可溶性砷的含量有顯著影響，隨著水分的含量的增加，可溶性砷的含量呈上升趨勢，形態未發生改變，僅有As（Ⅲ）和As（Ⅴ）；②單純性的溫度因素，樣品中可溶性砷的含量變化存在增多趨勢，最大增量分別是As（Ⅲ） 2.489 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.546 mg·g-1；③當水分與溫度共同作用時，樣品中可溶性砷的增加量發生顯著變化，最大增量分別是As（Ⅲ） 23.690 mg·g-1，As（Ⅴ） 0.468 mg·g-1。綜合分析認為：雄黃質量容易受到水分和溫度的影響，單純的水分，以及水分和溫度共同作用均能顯著改變雄黃中可溶性砷的含量，水分為高危因素。現行《中國藥典》2015年版中游離砷的檢測方法存在局限性，新的技術應當被引進；于此同時，現行藥典中雄黃藥材項下未設置水分檢查項，應當補足。

[關鍵詞] 雄黃； 水分； 溫度； 可溶性砷； 質量研究

[Abstract] The results of a toxicity analysis showed differences from those of the existing experimental data. Therefore， HPLC-ICP-MS was used to analyze the soluble arsenic content at different valences in realgar prepared with water grind processing， which were collected from 3 companies. The results showed that the free arsenic of the 3 companies did not exceed the limit of Chinese Pharmacopoeia. However， if the free arsenic was calculated based on the total value of As（Ⅲ） + As（Ⅴ）， free arsenic of 1 company exceeded the limit of Chinese Pharmacopoeia. The method of determining free arsenic in Chinese Pharmacopoeia. was ancient Cai′s arsenic detection method， which had a certain limitation and failed to effectively avoid the toxicity of remaining arsenics except for trivalent arsenic. Then， we examined the effects of water and temperature on the content and form of soluble arsenic in realgar. The results showed that the content of soluble arsenic increased with the rise of water content， and the form of soluble arsenic did not change， there were only As （Ⅲ） and As （Ⅴ）； With the simple temperature factor， there was an increasing trend in the content of soluble arsenic in the samples， the maximum increment was As （Ⅲ） 2.489 mg·g-1 and As （Ⅴ） 0.546 mg·g-1； When water and temperature played an synergistic effect， the increase of soluble arsenic in the samples significantly changed， the maximum increment was As （Ⅲ） 23.690 mg·g-1， As （Ⅴ） 0.468 mg·g-1， respectively. Through comprehensive analysis， we believed that the quality of realgar was susceptible to water content and temperature. Both of the single effect of water content and the synergistic effect of water and temperature can significantly change the content of soluble arsenic in realgar， and the water content was a high-risk factor. In the current Chinese Pharmacopoeia 2015 version， the free arsenic detection method had limitations， hence new techniques shall be introduced； At the same time， realgar does not have a water content inspection item in the current pharmacopoeia， which shall be added. However， due to the limit of water content， more in-depth studies are required.endprint

[Key words] realgar； water content； temperature； soluble arsenic； quality control

筆者對復方黃黛片方中各組分配伍毒性研究結果進行分析時發現，雄黃單用組LD50與已有研究[1]報道的LD50（20 500 mg·kg-1）相差顯著。進一步分析顯示，本研究使用的雄黃中可溶性砷達27.777 mg·g-1[其中As（Ⅲ）=21.968 mg·g-1，As（Ⅴ）=5.809 mg·g-1]，為參考文獻的16.38倍[1]，亦超過藥典對雄黃中三氧化二砷的限定值（7.020 mg·g-1） [2]。然而本研究中使用的雄黃與上述文獻中使用的為同一批號，其毒性結果卻差異巨大，提示雄黃在其生產之后的節點中存在易于改變其質量的影響因素。

目前所發表的文獻中，雄黃的質量研究大多數聚焦于晶型[3]、主成分含量[4]、炮制方法[5]、重金屬雜質[6]等，較少關注可溶性砷的形態及含量。質量控制主要關注生產過程，容易忽視生產之后的節點，如運輸、儲藏、臨床應用等。質量檢測方法也較為落后，如《中國藥典》2015年版使用的古蔡氏檢砷法、多數研究中使用的原子熒光法[7]，這2種方法存在不能準確定量以及不能區分砷形態等缺點。而先進的砷形態分析法[8]HPLC-ICP-MS卻尚未普及[9-10]。

基于上述現狀及事實，作者擬對收集到的市售3家企業的水飛雄黃的質量進行研究，并初步探究其影響因素。期望能提示使用水飛雄黃的科研人員注意關注其本身質量，并指導臨床的合理用藥，規避因藥物質量因素引起的不良反應的發生。

1 材料

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀（Agilent），7700x型電感耦合等離子體質譜儀（Agilent. USA），Dionex Ionpac AS19 陰離子交換柱（4 mm ×250 mm，10 μm，Thermo Fisher. USA），DHG 9240型干燥箱（北京陸希科技），高速離心機（Beckman Coulter，Inc. USA），Milliplus 2150超純水處理系統（Millipore USA）。

1.2 藥材及試劑

水飛雄黃（收集到3家企業，在此文章中分別以A，B，C企業代替）；色譜級乙腈、甲醇（Thermo Fisher. USA）；亞砷酸根離子As（Ⅲ） （GBW08666）、砷酸根離子As（Ⅴ） （GBW08667）、一甲基砷MMA（Ⅴ） （GBW08668）、二甲基砷DMA（Ⅴ） （GBW08669）、砷甜菜堿AsB （GBW08670）等砷標準物質均購自中國計量科學院；水為超純水，電阻率18.2 MΩ·cm，背景檢測無干擾；其余試劑均為優級純。

2 方法

2.1 干燥失重法測定樣品含水量

精密稱取水飛雄黃1.000 g，置于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，按《中國藥典》2015版一部附錄Ⅸ G干燥失重測定法測定。

2.2 市售樣品中可溶性砷形態分析及其含量測定

2.2.1 樣品前處理 精密稱取水飛雄黃1.000 g，加入超純水50 mL，振搖提取4～6次，合并提取液，500 mL量瓶定容、稀釋至所需濃度，0.22 μm濾膜過濾上機測定。

2.2.2 HPLC-ICP-MS測定不同形態砷的含量 本研究中砷形態分析及含量測定的工作由軍事醫學科學院野戰輸血研究所血液藥理研究室藥物代謝重點實驗室幫助完成，測定方法參考文獻[9]。

2.3 水分對水飛雄黃中可溶性砷的影響

實驗執行前，去除水飛雄黃樣品中的可溶性砷，作為對照。可溶性砷去除方法：稱取水飛雄黃適量，加入超純水50 mL，振搖、離心、去上清，重復4～6次，最后一次，抽濾，得濾渣烘干即得。實驗方案見表1。

實驗執行前，對2組樣本中的水分和可溶性砷含量進行質控。密封，放置于常溫，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.4 溫度對水飛雄黃中可溶性砷的影響

樣品前處理同2.3項下，溫度對水飛雄黃中可溶性砷的影響實驗方案見表2。樣品密封，放置于4 ℃、常溫、60 ℃環境，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.5 溫度與水分共同作用對水飛雄黃中可溶性砷的影響

樣品前處理同2.3項下，實驗方案見表3。樣品密封，按實驗方案放置，分別于7，14，28 d取樣測定。

2.6 數據統計

實驗數據用±s表示，采用SAS 8.1軟件2因素析因設計的方差分析進行組間比較，采用Graphpad prism軟件作圖。

3 結果

3.1 市售的3批樣品中水分及可溶性砷的含量

3批次樣品，游離砷含量檢查均符合《中國藥典》2015年版中古蔡氏檢砷法的規定，見表4。As（Ⅲ）的質量分數均低于7.02 mg·g-1，但若以As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的總和計算，批次為2的樣品中游離砷的含量超出藥典限度。與此同時，按照2015年版《中國藥典》對雄黃中主成分硫化砷的檢查結果表明，硫化砷質量分數均在藥典規定的不小于90%的范圍內。

3.2 各影響因素下，雄黃中可溶性砷的含量變化

3.2.1 水分對雄黃中可溶性砷的影響 樣品中可溶性As（Ⅲ）的增加量與樣品中水分的含量呈正相關趨勢，見圖1，可溶性As（Ⅴ）數據雖出現波動，但總體趨勢依然為正相關。且在時間維度上，隨著取樣時間的延長，可溶性As（Ⅲ）和As（Ⅴ）的增加趨勢更為顯著。為排除樣品本身攜帶的可溶性砷的影響，以實驗開始前已去除可溶性砷的樣品作為對照，趨勢重現性良好。

3.2.2 溫度對雄黃中可溶性砷的影響 單純的溫度因素影響下，樣品中可溶性As（Ⅲ）的含量變化存在增多趨勢，見圖2，最大增量為60 ℃、28 d、未去除可溶性砷的樣本，其As（Ⅲ）增加的量為2.489 mg·g-1。As（Ⅴ）含量變化趨勢一致，最大增量為0.546 mg·g-1。endprint

3.2.3 溫度和水分共同作用對雄黃中可溶性砷的影響 在溫度和水分的共同作用下，樣品中可溶性As（Ⅲ）的含量隨著取樣時間的延長而劇增，見圖3，最大增量為為60 ℃、 28 d、去除可溶性砷的樣本，其As（Ⅲ）的增量為23.690 mg·g-1。與單純的溫度或水分作用相比，數值變化具有顯著性差異。As（V）含量變化也顯升高趨勢，最大增量為0.468 mg·g-1，與單純的溫度或水分作用相比，數值變化沒有顯著性差異。

4 討論與建議

中藥安全性的評價存在諸多難點，如中藥成分復雜、毒性機制復雜、中藥作用多途徑、配伍應用多樣性、中藥效應多靶點、毒理效應綜合性[11-12]，如何克服這些難點，探清中藥作用的物質基礎、毒性機制是中藥安全性評價目前面臨的一大困境。而藥材基原清楚、質量可控是安全性評價的大前提，考慮到雄黃為確有療效的有毒中藥，特別是隨著砷劑在白血病及腫瘤方面的優越療效。其安全性已受到國內外學者的普遍關注。而全面的安全性評價是雄黃走向國際市場的基礎，為更好的評價其安全性，雄黃的質量控制研究勢在必行。

最新文獻表明，雄黃中的可溶性砷，特別是As（Ⅲ），既是雄黃發揮療效的物質基礎，也是產生毒性的物質基礎[13]，可溶性砷在雄黃中扮演著毒效一體的角色。現代醫學鼻祖、希臘醫生巴拉塞爾薩斯有一句名言：“萬物皆有毒，關鍵在劑量”。因此控制雄黃中可溶性砷的含量是安全應用雄黃的前提。

在本研究中，考察了水分和溫度2個因素對雄黃中可溶性砷含量的影響，結果表明水分和溫度均能引起可溶性砷含量的變化，且水分是高危因素。雄黃中隨著水分的增加，可溶性砷的含量顯著上升，且高溫能催化這一現象。但現行《中國藥典》2015年版中，雄黃藥材項下缺失水分檢查項目，可能帶來安全隱患。基于目前，僅考察了收集到的3批雄黃樣本，尚不能合理的制定水分的限值，這也是本研究的局限性，此部分還需要更廣泛、更深入的后續研究。研究結果雖然能推論出水分越低，雄黃的質量越穩定，但質量的穩定并不一定能帶來最大的療效收益，因為效和毒的物質基礎均為可溶性砷As（Ⅲ）。在此前提下，認為直接標示藥材中含有的可溶性砷的形態以及各形態砷的準確含量不失為一個更好的解決方案。

因此建議：①更新藥典標準，引入HPLC-ICP-MS分析技術監控雄黃中可溶性砷的含量，并關聯分析砷的形態；②雄黃的藥典標準中，補充“水分檢查”項目，控制水分；③臨床使用前，若能動態監控，及時根據雄黃中可溶性砷的含量調整雄黃的給藥劑量，并警示雄黃可能的毒性危害，監測患者血液中可溶性砷的形態及濃度。筆者期望不僅能避免雄黃可能的毒性危害，更期望能促進雄黃在全球范圍內的廣泛接受和使用。雄黃，以毒為能、毒效并存，可控的質量是其被接受的前提，也是其生命線。

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[責任編輯 孔晶晶]endprint