纖維素酶-超聲波輔助法提取葡萄籽原花青素的工藝研究

俞騰飛，裴允彤，張

（北京化工大學化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，PC） 是植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，多存在于葡萄、山楂、花生、銀杏、松樹等植物的果實、籽和皮中，具有良好的抗氧化性和清除自由基能力[1-3]，是目前國際上公認的清除人體內自由基最有效的天然抗氧化劑。原花青素在人體內能被快速吸收，口服20 min內就能在人體血液中達到最高濃度，其在人體內抗自由基氧化能力可以達到等量VC的20倍和等量VE的50倍，能及時有效地清除血液中的自由基。正因為原花青素的這種強抗氧化能力，使其廣泛用于治療臨床上的水腫、糖尿病性視網膜病、靜脈曲張和過敏發炎等疾病。除此之外，原花青素還具有恢復人體膠原蛋白活力的能力，因此可用于生產口服營養品和化妝品，使皮膚平滑而富有彈性，達到保健的功效。原花青素還能保護人體免受陽光傷害，促進牛皮癬和壽斑的愈合，因此原花青素也是某些皮膚霜的極好添加劑。

目前，國內外提取原花青素的主要方法有溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、酶解法和超臨界流體萃取法等。其中，酶解法[4]能夠使植物組織分解，加速有效物質的溶出，從而提高提取率，但酶解時間一般略長，不利于工業化生產；超聲波輔助萃取[5]是一種物理破碎過程，超聲波的空化作用及其所產生的熱效應、乳化、擴散、擊碎等次級效應，有利于細胞內有效物質的釋放、擴散及溶解，并且具有無污染、操作簡單、提取快速、提取效率高等優點，在植物萃取中具有良好的應用前景。目前，已有不少關于酶解法與超聲波法提取植物中有效成分的研究[6-7]，但是二者同時應用于葡萄籽中原花青素的提取研究還鮮有報道。試驗將纖維素酶及超聲波共同作用于葡萄籽原花青素的提取中，通過單因素試驗和正交試驗確定最佳提取條件，以期最大限度地提高原花青素的提取率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤露珠葡萄籽、原花青素標準品（阿拉丁試劑，純度≥95%），上海伊卡生物技術有限公司提供；纖維素酶（酶活性：15 000 U/g），北京格林博遠生物科技有限公司提供；甲醇、乙醇、石油醚（60～90℃）、香草醛、濃鹽酸、醋酸、醋酸鈉等，均為國藥分析純。

LE204E/02型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；JA5003型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司產品；T6型新世紀紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產品；SHZ-D（Ⅲ）型循環水式多用真空泵，河南省予華儀器有限公司產品；RE-52A型旋轉蒸發器，北京神泰偉業儀器設備有限公司產品；KQ3200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；HY-2A型數顯調速多用振蕩器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限責任公司產品；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限責任公司產品；TG16-WS型臺式高速離心機，長沙市維爾康湘鷹離心機有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 原花青素標準曲線的繪制

精確稱取原花青素標準品0.100 8 g置于燒杯中，加入少量蒸餾水溶解后緩緩倒入100 mL容量瓶中（燒杯多次洗滌后的液體均倒入容量瓶內），加蒸餾水至容量瓶100 mL刻度，搖勻。用移液槍分別精確吸取2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至容量瓶25 mL刻度，搖勻。吸取上述各種濃度的樣品液0.5 mL于20 mL試管中，以蒸餾水作為空白對照，加入香草醛-甲醇溶液（0.04 g/mL）3 mL，再加入1.5 mL濃鹽酸，搖勻后放入30℃水浴中反應30 min[8]。將上述液體加入到比色皿中，以空白對照為基準，在550 nm處測其吸光度，以原花青素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

原花青素標準曲線見圖1。

圖1 原花青素標準曲線

吸光度A=1.043 1C-0.002 3.

式中：C——原花青素質量濃度，mg/mL；

A——吸光度。

1.2.2 原花青素提取率的測定

將得到的葡萄籽原花青素提取液稀釋一定倍數后，按照1.2.1測定標準曲線的方法在550 nm處測定其吸光度，根據標準曲線回歸方程計算得到稀釋液中原花青素質量濃度，然后乘以稀釋倍數即可得到提取液中原花青素質量濃度，從而得出提取率。

式中：C——提取液中原花青素質量濃度，mg/mL；

V——提取液體積，mL；

m——脫脂葡萄籽質量，mg。

1.2.3 原料預處理

將葡萄籽洗凈后，放入一定溫度的烘箱內充分干燥，用粉碎機粉碎干燥后的葡萄籽，過40目篩，按葡萄籽質量與石油醚浸泡液體積1∶5的比例浸泡葡萄籽24 h（葡萄籽脫脂），過濾、干燥后得到備用的脫脂葡萄籽。

1.2.4 單因素試驗

（1）纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響。準確稱取5份干燥的脫脂葡萄籽1.000 g置于100 mL具塞三角瓶內，各加入30 mL 60%的乙醇溶液，加入緩沖溶液調節pH值至5.0，纖維素酶的添加量分別為6，8，10，12，14 mg/g，放入超聲波儀內超聲20 min。待超聲完成后，提取液經離心、過濾后移至100 mL容量瓶內，并向容量瓶加去離子水至100 mL刻度線，測定原花青素的含量，從而確定纖維素酶的最適添加量。

（2）提取劑體積分數對原花青素提取率的影響。乙醇體積分數分別為40%，50%，60%，70%，80%，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查不同體積分數的乙醇溶液對原花青素提取率的影響。

（3）料液比對原花青素提取率的影響。分別加入60%的乙醇溶液20，25，30，35，40 mL，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查不同料液比對原花青素提取率的影響。

（4）超聲時間對原花青素提取率的影響。超聲時間分別為10，15，20，25，30 min，纖維素酶添加量10 mg/g，其余條件同（1），測定原花青素的含量，考查超聲時間對原花青素提取率的影響。

1.2.5 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對纖維素酶添加量、乙醇體積分數、料液比、超聲時間4個因素分別取3個水平，按照L9（34）正交表進行優化組合試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響見圖2。

圖2 纖維素酶添加量對原花青素提取率的影響

纖維素酶能夠促使葡萄籽中的纖維素水解，使植物細胞壁部分破損，細胞膜就會因此發生一定程度的變形或破裂，從而增加膜的滲透性，降低傳質阻力，促使原花青素更快地溶出[9-10]。由圖2可知，纖維素酶添加量在10 mg/g以下時，原花青素提取率隨纖維素酶添加量的增加而上升，在10 mg/g時達到最大值，超過此值后原花青素提取率反而下降。這是因為在纖維素酶添加量較低時，酶解反應尚未進行完全，隨著酶添加量的增加，反應趨于完全，繼續增加酶添加量，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制[11]。因此，選擇纖維素酶添加量10 mg/g左右較為合適。

2.2 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

乙醇體積分數對原花青素提取率的影響見圖3。

圖3 乙醇體積分數對原花青素提取率的影響

由圖3可知，隨著乙醇體積分數的增加，原花青素提取率增大；當乙醇體積分數達到50%時，提取率達到最高。此后，再增加乙醇體積分數，原花青素提取率反而降低。這是由于乙醇體積分數較高時，一些醇溶性雜質、親脂性強的成分浸出量增加，這些成分會與乙醇、水分子結合，與原花青素的溶解形成競爭，從而導致原花青素的提取率下降[12]。因此，選擇乙醇體積分數為50%左右。

2.3 料液比對原花青素提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對原花青素提取率的影響

由圖4可知，在初始階段，原花青素的提取率隨料液比的增加而增大，在1∶35（g∶mL） 時達到最大值。繼續增加料液比，原花青素提取率稍有下降。這是由于過量的溶劑一方面會稀釋酶的濃度，從而減小酶與底物的接觸幾率；同時也會導致其他雜質的溶出，從而降低了原花青素的提取率。

2.4 超聲時間對原花青素提取率的影響

超聲時間對原花青素提取率的影響見圖5。

圖5 超聲時間對原花青素提取率的影響

由圖5可知，在10～30 min的超聲時間內原花青素提取率呈現先增加后下降的趨勢，在15～25 min時間內提取率幾乎不變。出現這種結果的原因，可能和纖維素酶與超聲波的協同作用有關。在較短的時間內，隨著超聲時間的增加，原花青素的溶出量增加，提取率增大；在15～25 min過程中，原花青素提取率維持在一個相對穩定的狀態；超過25 min后，由于體系中的溫度過高，使得纖維素酶逐漸失活，同時原花青素的結構也發生變化，提取率開始下降。考慮到能耗成本，因此超聲時間選擇15 min左右為宜。

2.5 酶解溫度對原花青素提取率的影響

有關研究數據表明[9]，在一定范圍內，酶解溫度對原花青素提取率無明顯影響，因此試驗中沒有專門研究酶解溫度對原花青素提取率的影響。

2.6 正交試驗結果與分析

L9（34）正交試驗結果見表2，正交試驗方差分析見表3。

表2 L9（34）正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

由表2可知，4個因素對葡萄籽原花青素提取效果影響的主次順序為A＞C＞B＞D。最佳工藝條件為A1B3C3D2，即纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min。

由表3可知，4個因素中纖維素酶添加量對提取率有比較顯著的影響，乙醇體積分數、料液比和超聲時間對提取率無顯著影響。

2.7 驗證試驗及討論

按照正交試驗得到的最佳提取條件：纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min進行試驗，脫脂葡萄籽原花青素的提取率為17.2%。同等條件下，不添加纖維素酶，單獨超聲時原花青素的提取率僅為14.6%。以上數據表明，纖維素酶協同超聲波輔助法對葡萄籽原花青素的提取率有一定的提高作用。

據文獻報道[10-15]，超聲波對纖維素的活性有促進作用，分析產生這種結果的原因可能包括以下幾個方面：①超聲波能產生強烈的空化及振蕩作用，增大了酶與底物的接觸頻率，同時纖維素酶可破壞植物細胞壁而降低超聲過程中的傳質阻力[16]，二者協同作用加快有效物質的溶出，提高原花青素提取率；②當超聲時間在一定范圍內，超聲波作用于纖維素酶時，不但不會降低酶的活性，還能產生能量促進酶介導反應的發生，增強了纖維素酶的活性[17-18]；③超聲過程中產生的熱效應提高了反應體系的溫度，加快分子運動速率，從而促進酶解反應的進行[19]。

3 結論

對脫脂葡萄籽進行了纖維素酶協同超聲波輔助法提取的研究，在單因素試驗的基礎上，設計正交試驗確定了最佳提取條件為纖維素酶添加量8 mg/g，乙醇體積分數55%，料液比1∶40（g∶mL），超聲時間20 min，測得原花青素的提取率為17.2%，單獨使用超聲波法用于脫脂葡萄籽原花青素提取時，原花青素提取率為14.6%，該法比單純的超聲波法提高了17.8%。纖維素酶協同超聲波輔助法結合了酶提取法與超聲波提取法的優點，利用二者的相互促進作用顯著提高了葡萄籽原花青素提取率，具有提取時間短、條件溫和、提取率高等優點，為植物中有效成分的提取提供了新途徑。

[1]李春陽，許時嬰，王璋.DPPH法測定葡萄籽原花青素清除自由基的能力 [J].食品科學，2006，25（2）：103-106.

[2]Da Silva JMR，Darmon N，Fernandez Y.Oxygen free radical scavenger capacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1991，39 （9）：1 549-1 552.

[3]余瑩，粟武，魏東芝.原花青素體外清除自由基活性的研究 [J].華東理工大學學報，2002，28（3）：318-320.

[4]張圣燕.纖維素酶在天然產物提取中的應用研究 [J].廣東化工，2011，38（9）：59-60.

[5]蘇芳，顧明廣，馮獻起.超聲波輔助法提取葡萄籽中原花青素工藝的研究 [J].中國釀造，2015，34（12）：113-116.

[6]李小龍，雍其歡，崔秋兵.纖維素酶-超聲波輔助提取泡姜姜辣素的研究 [J].中國釀造，2015，34（6）：103-106.

[7]張利芳，張名位，黃文，等.纖維素酶協同超聲波輔助提取苦瓜多糖工藝優化 [J].農業機械學報，2010，41（11）：143-147.

[8]李綺麗，吳衛國，彭芳剛，等.蓮子皮原花青素測定方法的研究 [J].現代食品科技，2012，28（2）：241-245.

[9]胡位榮，王競婄，蘇韓，等.響應面法優化火龍果皮中原花青素提取工藝 [J].廣東農業科學，2013，40（20）：97-100.

[10]吳春，張艷.纖維素酶法提取葡萄籽中原花青素的研究 [J].食品科學，2006，27（10）：258-261.

[11]陶濤，李立祥，張芳，等.超聲波協同纖維素酶對黃精多糖和皂苷的提取研究 [J].食品工業科技，2012，33（9）：271-275.

[12]崔倩，蔣益虹，戴蕾，等.蓮房原花青素的提取純化技術研究 [J].食品工業科技，2011，32（8）：238-241.

[13]高大維，于淑娟，閔亞光.超聲波對纖維素酶活力的影響 [J].華南理工大學學報 （自然科學版），1997（11）：22-26.

[14]于淑娟，高大維.超聲波作用下纖維素酶水解反應動力學的研究 [J].廈門大學學報（自然版），1997（3）：424-429.

[15]于淑娟,高大維.超聲波強化纖維素酶水解反應機理研究 [J].華南理工大學學報（自然科學版），1998（11）：90-95.

[16]劉富梁，金衛根，梁華正，等.酶法在中藥提取中的研究進展 [J].時珍國醫國藥，2006，17（7）：1 152-1 153.

[17]Szabóoe，Csiszár E.The effect of low-frequency ultrasound on the activity and efficiency of a commercial cellulase enzyme[J].Carbohydrate Polymers，2013 （2）： 1 483-1 489.

[18]何澤超.纖維素的酶水解及超聲波對其加速作用的研究 [D].成都：四川大學，2001.

[19]楊進妹，王婷，何榮海.超聲對酶解反應的影響 [J].農產品加工，2010（7）：70-73.◇