克百威人工抗原合成及其免疫應用

孫鳳霞，康立超，龐芳琴，刑麗杰，羅瑞峰，羅小玲，彭夏雨

(省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室 / 新疆農墾科學院 分析測試中心，新疆 石河子 832000)

克百威(Carbofuran, CBF)，化學名為2,3-二氫-2,2-二甲基-7-苯并呋喃基-N-甲基氨基甲酸酯，商品名為呋喃丹，是一種廣譜高效的氨基甲酸酯類農藥，主要用于農業生產中多種農作物害蟲的防治?？税偻梢院湍憠A酯酶發生不可逆結合，造成乙酰膽堿不能分解而蓄積在體內，影響神經中樞傳導，具有神經毒性和胃毒?？税偻谒嵝酝寥乐胁灰捉到?，殘留期長，可被植物根部吸收并輸送到植物體的各器官，主要積蓄在植物葉部；也可能通過徑流滲透污染地下水源，給食品安全和環境帶來潛在威脅[1-3]。目前，農業部已禁止將克百威用于蔬菜、果樹、茶葉和中草藥材的生產種植，但仍有不少違法使用現象時有發生,導致克百威殘留在果蔬等產品中。因此，在持續加大使用監管力度和完善監管體系的同時，加強克百威殘留檢測技術研究十分必要。

目前克百威的檢測多采用儀器分析法[4-6]，需要昂貴的儀器設備和專業技術人員，對檢材要求較高，樣品前處理和提純過程費時費力，不能滿足現代檢測對方便、快速、準確的要求。電化學傳感器法具有靈敏度高、選擇性好和檢測時間短的特點，在克百威殘留檢測上也得到一定的應用[7-8]，但該方法檢測樣本數量單一，難以實現高通量檢測，不能滿足現場檢測和大批量樣品篩選需求。免疫分析法操作簡便，對樣本要求不高，可實現現場快速檢測，是21世紀最有競爭力的分析方法，已被應用于克百威殘留檢測[9-15]。

農藥免疫分析的關鍵是制備高特異性的抗體，包括半抗原設計、人工抗原合成及抗體制備，而半抗原的設計與合成是農藥免疫分析的前提、基礎和關鍵。做為典型的小分子化合物，克百威本身不具有免疫原性，同時其結構中不含有可直接偶聯的功能基團，需要進行半抗原衍生化或者人工合成。Abad等[9]設計合成4種克百威半抗原(表1)，根據抗體制備和免疫分析結果，確定免疫效果最好的克百威半抗原為4-[〔(2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧)羰基〕氨基]丁酸(BFNB)。因而在此后的克百威免疫分析中，多選用BFNB作為免疫半抗原，但其合成方法普遍采用傳統的三光氣合成工藝，需要使用大量光氣和甲苯，極易危害健康，造成環境污染。因此，本研究以克百威水解產物呋喃酚為起始原料，設計新型合成方法制備半抗原BFNB并對其結構進行鑒定，利用活性酯法制備人工抗原，免疫小鼠獲得特異性識別克百威的多克隆抗體，為建立克百威免疫檢測方法和保障農產品安全提供物質基礎。

表1 克百威4種半抗原的結構Table 1 The chemical structures of four haptens

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗動物 4只SPF級BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡)購自新疆疾病預防控制中心。

1.1.2 主要試劑 克百威標準品購自農業部環境質量監督檢驗測試中心(天津)；呋喃酚(純度99%)、二(對硝基苯)碳酸酯(純度≥99%)、4-氨基丁酸甲酯(純度≥99%)、三氟醋酸(純度≥99.8%)、三乙胺(純度≥99%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，純度98%)、N,N-二環己基碳二亞胺(DCC，純度≥99%)、牛血清白蛋白(BSA，純度≥98%)、弗氏完全佐劑和不完全佐劑等均購自Sigma公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(HRP-IgG)為Jackson公司產品；Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢劑兼容型)購自上海碧云天生物技術有限公司；二氧六環、乙酸乙酯、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，均購自國藥集團上?；瘜W試劑總公司；試驗用水為Millipore超純水；上述試劑若無特別注明均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 克百威半抗原BFNB的合成及純化 取一四口燒瓶置于恒溫磁力攪拌器(上海滬西分析儀器廠)上，配置溫度計。稱取1.64 g呋喃酚溶解于50 mL 二氯甲烷(DCM)中，冰浴下加入1.11 g三乙胺(Et3N)。攪拌10 min后，將3.04 g二(對硝基苯)碳酸酯溶于15 mL二氯甲烷中，緩慢滴加到上述反應體系中，緩慢升溫至室溫，繼續攪拌反應1 h，TLC板監控反應完成，展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1，此為溶液A；稱取1.697 g經三乙胺堿化的4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽溶于10 mL二氯甲烷中，在冰浴下滴加到A液中，將溫度升到室溫并繼續攪拌過夜；用水、飽和食鹽水依次洗滌并用無水硫酸鈉干燥，濾液真空旋干后用硅膠柱層析純化，得到半抗原中間體B，收率為58%；將B溶于15 mL 1,4-二氧六環溶液中，加入18 mL三氟醋酸和15 mL水，60 ℃反應4 h后冷卻至室溫；反應液用乙酸乙酯萃取后，依次用水、飽和碳酸氫鈉、水、飽和食鹽水進行洗滌，用無水硫酸鈉干燥，濾液真空旋干后用硅膠柱層析純化后即可得到克百威半抗原BFNB，洗脫劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=5∶1，收率為42%，合成路線見圖1。

圖1 克百威半抗原BFNB合成路線Fig.1 Synthetic route of hapten BFNB

1.2.2 克百威半抗原BFNB的鑒定 將純化后的克百威半抗原BFNB采用核磁共振儀和LC-MS2進行分子結構鑒定，以確定半抗原是否合成成功。

1.2.3 克百威人工抗原的合成 免疫原(BFNB-BSA)采用活性酯法進行合成，控制半抗原BFNB與載體蛋白BSA的反應摩爾比為80∶1，稱取29.3 mg半抗原BFNB、13.8 mg NHS溶于1 mL無水DMF中，待其充分溶解完全后加入24.3 mg DCC，室溫攪拌反應過夜；離心去沉淀，收集上清，此為A液；稱取BSA 83 mg溶解在5 mL 0.01 mol/L PBS溶液中，為B液；在冰水浴中，將A液逐滴滴加到B液中，4 ℃攪拌過夜。反應混合液用PBS緩沖液透析3 d，6～8 h換液1次，離心取上清，分裝于0.5 mL離心管中， 20°C保藏，標記為BFNB-BSA，合成路線見圖2。

包被原(BFNB-OVA)在合成中將載體蛋白更改為卵清蛋白(OVA)，控制半抗原BFNB與OVA的反應摩爾比為40∶1，其余步驟與免疫原的合成相同。

圖2 克百威人工抗原的合成路線Fig.2 Synthetic route of CBF complete antigen

1.2.4 克百威人工抗原的鑒定 采用紫外掃描光譜法對克百威人工抗原進行鑒定，并計算半抗原BFNB和載體蛋白的偶聯比，半抗原、人工抗原和載體蛋白用PBS緩沖液稀釋后，分別在波長200～400 nm進行全波長掃描，根據紫外掃描光譜的疊加情況判斷半抗原和載體蛋白是否偶聯成功，并根據半抗原特征吸收波長處的吸光度計算半抗原BFNB和載體蛋白的偶聯比[16]，公式為：

偶聯比=(ε偶聯物-ε蛋白)/ε半抗原

式中：ε為在半抗原特征吸收波長 278 nm處的摩爾吸光系數。

1.2.5 抗克百威多克隆抗體的制備 將制備的BFNB-BSA做為免疫原免疫BALB/c小鼠，免疫程序和方法參照文獻[17]。首次免疫采用弗氏完全佐劑乳化抗原，背部皮下多點免疫，免疫劑量為每只100 μg。加強免疫采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量為每只75 μg。第4次免疫7 d后斷尾采血，分離血清測定效價。將BFNB-OVA作為包被抗原，利用方陣法確定最佳的抗原抗體工作濃度，用間接競爭酶聯免疫法(ELISA)對血清進行靈敏度測定[18]。

2 結果與分析

2.1 半抗原BFNB的結構分析與鑒定

呋喃酚分子質量為164，4-氨基丁酸甲酯分子質量為169，衍生產物BFNB分子質量為293。由圖3可知，在多反應監測模式(MRM)下半抗原BFNB的保留時間為0.92 min，母離子為294.3，其為M+1；對母離子進行能量碰撞，產生165.1的碎片離子，分析165.1是半抗原BFNB的氨基甲酸酯鍵發生斷裂，產生的呋喃酚碎片；當碰撞能量繼續提高，呋喃環上的C-O鍵和C-C鍵發生斷裂，產生了123.1的碎片離子，據此可以推斷半抗原BFNB合成成功。

圖3 克百威半抗原BFNB的質譜圖Fig.3 The MS spectrum of hapten BFNB

圖4 克百威半抗原BFNB的H譜Fig.4 1H NMR of CBF haptens BFNB

半抗原BFNB經1H NMR (500 MHz, CDCl3)測定，鑒定其分子結構(圖4)，其1H NMR為：δ為6.97 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.78 (t, J = 7.0 Hz, 8.0 Hz, 1H), 5.24 (br, 1H), 3.34 (m, 2H), 3.03 (s, 2H), 2.46 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.49 (s, 6H)，所得結構信息與化合物BFNB的結構信息相同，從而確定該化合物為目標半抗原BFNB。

2.2 克百威人工抗原的紫外掃描鑒定

紫外光譜結果如圖5所示，半抗原BFNB和載體蛋白BSA的最大特征吸收均在278 nm，在同樣濃度下，BFNB-BSA偶聯物相比BSA的最大特征吸收峰的強度發生了明顯增強，呈現一定的光譜疊加趨勢。另外，BFNB在245 nm處為特征峰間谷點，BSA在252 nm處為特征峰間谷點，而偶聯物BFNB-BSA的特征峰間谷點在250 nm處，介于BFNB和BSA的峰間谷點之間，發生了偏移，說明偶聯物中形成了新的化合物結構，證明人工抗原BFNB-BSA偶聯成功。根據計算得到人工抗原BFNB-BSA的偶聯比約為17∶1，同法計算包被原BFNB-OVA的偶聯比約為8∶1。

圖5 人工抗原BFNB-BSA的紫外掃描圖Fig.5 Ultraviolet spectrum of the antigen BFNB-BSA

2.3 多克隆抗體的鑒定結果

2.3.1 多克隆抗體效價測定 采用間接ELISA法對4免抗血清進行效價測定，當包被原BFNB-OVA包被質量濃度為0.5 μg/mL時，4種抗血清效價均達到1∶9 000以上，其中2號小鼠血清效價達到1∶27 000，說明制備的免疫原具有良好的免疫原性，所制備的包被原也可以很好的用于免疫檢測。

2.3.2 多克隆抗體靈敏度測定 經方陣法確定包被原最佳包被質量濃度為0.5 μg/mL，抗血清最佳工作稀釋倍數為8 000倍。采用間接競爭ELISA法對抗血清進行靈敏度測定，以克百威質量濃度的對數值為橫坐標，OD450的吸光值為縱坐標，通過四參數回歸方程擬合曲線，得到競爭抑制曲線(圖6)，定量檢測線性(IC20～IC80)為0.023～0.403 μg/mL，半數抑制濃度(IC50)為0.096 μg/mL。

圖6 抗體的間接競爭ELISA抑制曲線Fig.6 Standard inhibition curve of polyclonal antiserum detected by icELISA

3 討 論

免疫分析法是以抗體對抗原的特異性識別作用為基礎的分析方法，免疫檢測已被應用于農產品中多種農藥殘留檢測[19]?？贵w是所有免疫檢測方法的關鍵試劑，對于小分子農藥而言，其半抗原設計、篩選和合成是制備抗體的關鍵環節。克百威的半抗原主要根據Abad等[9]篩選的4種半抗原，其中免疫效果最好的抗體來源于半抗原BFNP和BFNB，半抗原合成方法普遍采用傳統的三光氣法，如楊金易等[20]采用光氣合成法合成BFNB作為半抗原，成功制備了高親和力的抗克百威單克隆抗體，并建立相應的免疫分析方法。朱國念等[21]和Zhu等[22]利用光氣法合成半抗原BFNB、BFNH和BFNP。 由于三光氣合成法中需要使用大量有機溶劑甲苯和光氣，危害操作人員身體健康，造成二次環境污染，研究者們開始尋找克百威半抗原新的合成方法，如朱德銳[23]以克百威、對硝基苯氯甲酸酯、6-氨基己酸為反應原料，開辟克百威半抗原BFNH新的合成方法，避免傳統三光氣合成法的危害。本研究以克百威水解產物呋喃酚為起始原料，首先與二(對硝基苯)碳酸酯和4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽反應生成中間體，再和三氟醋酸反應合成半抗原BFNB，經質譜和核磁共振測定半抗原BFNB合成成功，同時合成步驟簡潔有效，得率高，避免傳統三光氣合成方法中大量使用光氣和甲苯的危害性，為克百威半抗原提供了新的合成方法。

人工抗原的結構決定抗體對目標抗原的親和力、選擇性和靈敏度，直接影響免疫分析方法的結果。人工抗原的鑒定主要采用紫外光譜法和蛋白電泳法[24]，其中紫外光譜法可以同時計算偶聯比，且操作簡單快捷，被廣泛使用。人工抗原的偶聯比即半抗原與載體蛋白的最佳分子結合比對抗體的產生和質量有著重要影響。關于最佳偶聯比，不同研究者的結果有所不同。通常認為半抗原分子與載體蛋白的偶聯比在5∶1～25∶1最佳[25]。對于克百威半抗原BFNB，楊金易等[20]和朱國念等[21]分別通過活性酯法制備完全抗原BFNB-BSA，其偶聯比均為13∶1；本研究制備的克百威免疫原的偶聯比約為17∶1，處于適宜范圍內。

同時，動物免疫試驗結果進一步證明克百威人工抗原合成成功，所獲得的鼠源抗克百威多克隆抗體的IC50值為0.096 μg/mL，線性(IC20～IC80)為0.023～0.403 μg/mL。研究所制備的克百威半抗原為進一步制備抗克百威高特異性單克隆抗體和建立克百威免疫分析方法奠定了物質基礎。

Reference：

[1] CAMPBELL S,DAVID M D,WOODWARD L A,etal.Persistence of carbofuran in marine sand and water [J].Chemosphere,2004,54(8):1155-1161.

[2] MOREIRA R A,MANSANO A D S,ROCHA O.The toxicity of carbofuran to the freshwater rotifer,Philodinaroseola[J].Ecotoxicology,2015,24(3):604-615.

[3] GBADEGESIN M A,OWUMI S E,AKINSEYE V,etal.Evaluation of hepatotoxicity and clastogenicity of carbofuran in male Wistar rats [J].Food&ChemicalToxicology,2014,65(1):115-119.

[4] KHODADOUST S,TALEBIANPOOR M S,GHAEDI M,etal.Application of an optimized dispersive nanomaterial ultrasound-assisted microextraction method for preconcentration of carbofuran and propoxur and their determination by high-performance liquid chromatography with UV detection [J].JournalofSeparationScience,2014,37(21):3117-3124.

[5] 張 璇,姜 敏,劉 峰,等.高效液相色譜-質譜聯用儀檢測蘋果中的丁硫克百威和克百威的殘留量 [J].農藥科學與管理,2015,36(6):44-48.

ZHANG X,JIANG M,LIU F,etal.Determination of carbofuran and carbosulfan residues in apples by high performance liquid chromatography-mass spectrometry [J].PesticideScienceandAdministration,2015,36(6):44-48.

[6] 羅俊凱,龔道新,丁春霞,等.氣相色譜-質譜法測定煙葉和土壤中丁硫克百威及其代謝產物的殘留[J].農藥學學報,2014,16(1):66-71.

LUO J K,GONG D X,DING CH X,etal.Determination of carbosulfan and its metabolites residues in tobacco leaf and soil by gas chromatography-mass spectrometry [J].ChineseJournalofPesticideScience,2014,16(1):66-71.

[7] TAN X C,HU Q,WU J W,etal.Electrochemical sensor based on molecularly imprinted polymerreduced graphene oxide and gold nanoparticles modified electrodefor detection of carbofuran [J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2015,220(16):216-221.

[8] GRAWE G F,DE OLIVEIRA T R,DE A N E,etal.Electrochemical biosensor for carbofuran pesticide based on esterases fromEupenicilliumsheariiFREI-39 endophytic fungus [J].BiosensorsandBioelectronics,2015,63(1):407-413.

[9] ABAD A,MORENO M J,MONTOYA A.Development of monoclonal antibody-based immunoassays to the N-methylcarbamate pesticide carbofuran [J].JournalofAgriculturalandFoodChemistry,1999,47(6):2475-2485.

[10] DAI Y P,WANG T,HU X Y,etal.Highly sensitive microcantilever-based immunosensor for the detection of carbofuran in soil and vegetable samples [J].FoodChemistry,2017,229(16):432-438.

[11] LIU L,XU D,HU Y Y,etal.Construction of an impedimetric immunosensor for label-free detecting carbofuran residual in agricultural and environmental samples [J].FoodControl,2015,53(7):72-80.

[12] ZHU Y,CAO Y Y,SUN X,etal.Amperometric immunosensor for carbofuran detection based on MWCNTs/GS-PEI-Au and AuNPs-antibody conjugate [J].Sensors,2013,13(4):5286-5301.

[13] YANG J Y,ZHANG Y,WANG H,etal.Development of fluorescence polarisation immunoassay for carbofuran in food and environmental water samples [J].Food&AgriculturalImmunology,2014,26(3):340-355.

[14] GUO Y R,LIU S Y,GUI W J,etal.Gold immunochromatographic assay for simultaneous detection of carbofuran and triazophos in water samples [J].AnalyticalBiochemistry,2009,389(1):32-39.

[15] 金仁耀,朱國念.基于雙特異性單克隆抗體的克百威和三唑磷多殘留ELISA分析方法研究及在環境樣品中應用 [J].核農學報,2013,27(4):515-522.

JIN R Y,ZHU G N.Development of a multi-residue enzyme-linked immunoassay based on bispecific bonoclonal antibody for carbufuran and triazophos and its environmental application [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2013,27(4):515-522.

[16] 袁 媛.糖皮質激素多殘留免疫研究與量子點在免疫分析中的應用 [D].江蘇無錫:江南大學,2009.

YUAN Y.Determination of corticosteroids multi-residues and application of quantum dots in immunoassay [D].Wuxi Jiangsu:Jiangnan University,2009.

[17] SUN F X,LIU L Q,KUANG H,etal.Development of ELISA for melamine detection in milk powder [J].FoodandAgriculturalImmunology,2013,24(1):79-86.

[18] KONG N,SONG S S,PENG J,etal.Sensitive,fast,and specific immunoassays for methyltestosterone detection [J].Sensors,2015,15(5):10059-10073.

[19] 王玲玲,職愛民,胡驍飛,等.百菌清人工抗原的合成及多克隆抗血清的制備 [J].西北農業學報,2012,21(9):19-23.

WANG L L,ZHI A M,HU X F,etal.Synthesis of chlorothalonil artificial antigen and development of its mice polyclonal antiserum [J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentatisSinica,2012,21(9):19-23.

[20] 楊金易,吳 青,王 弘,等.高親和力的農藥克百威單克隆抗體的制備及鑒定 [J].中國農業科學,2007,40(3):518-523.

YANG J Y,WU Q,WANG H,etal.Production and identification of high affinity monoclonal antibodies against pesticide carbofuran [J].ScientiaAgriculturaSinica,2007,40(3):518-523.

[21] 朱國念,吳銀良,程敬麗.克百威人工抗原的合成與鑒定 [J].浙江大學學報(農業與生命科學版),2002,28(1):47-53.

ZHU G N,WU Y L,CHENG J L.Synthesis and identification of the antigens for carbofuran [J].JournalofZhejiangUniversity(Agriculture&LifeSciences),2002,28(1):47-53.

[22] ZHU G N,JIN M J,GUI W J,etal.Development of a direct competitive enzyme-linked immunoassay for carbofuran in vegetables [J].FoodChemistry,2008,107(4):1737-1742.

[23] 朱德銳.呋喃丹半抗原合成與多克隆抗體制備及其檢測應用 [D].武漢：華中師范大學,2008.

ZHU D R.Design and synthesis the hapten molecular of carbofuran and the preparation of polyclonal antibody for the application on testing [D].Wuhan:Central China Normal University,2008.

[24] 胡驍飛,鄧 歌,柴書軍,等.玉米赤霉醇完全抗原的制備及質量鑒定 [J].西北農業學報,2016,25(5):637-645.

HU X F,DENG G,CHAI SH J,etal.Preparation and quality identification of complete antigen of zeranol[J].ActaAgriculturaeBoreali-occidentatisSinica,2016,25(5):637-645.

[25] EILANGE B F.The preparation of antigenic hapten-carrier conjugates:a survey [J].MethodsinEnzymology,1980,70(A):85-104.