蒙藥熊膽治療應激性胃潰瘍出血模型大鼠的主要成分及機制研究

薩茹拉 吳玉小 吳偉紅 白 珍 白長喜

(1 天津中醫藥大學，天津，300193； 2 內蒙古自治區國際蒙醫醫院，呼和浩特，010065； 3 內蒙古醫科大學蒙醫藥研究所，呼和浩特，010020)

胃潰瘍出血屬于上消化道出血，胃損傷、潰瘍是導致胃出血的常見原因[1]。胃潰瘍及消化性潰瘍是一種常見的消化道疾病。主要的病因由幽門螺旋桿菌感染和藥物及飲食因素導致。如長期服用阿司匹林、皮質類固醇等藥物及長期吸煙、飲酒、喝濃茶、咖啡等易致此病發生。出血是胃潰瘍最常見的并發癥，是潰瘍基底血管被侵蝕破裂所致，因此止血與促進潰瘍修復、愈合是胃潰瘍合并出血治療的關鍵手段[2]。

蒙醫學認為胃潰瘍出血屬“血病”的一種，蒙醫藥治療“三根”失調導致的胃潰蕩出血有著豐富的經驗和獨到的特色，在蒙醫學理論體系中，胃潰瘍出血的病因為飲食不節，邪熱傷肝，水谷精不能化，惡血激增溢于胃，血不循徑，三根失調導致[3]。本實驗為了探討蒙藥熊膽及主要有效成分治療胃潰瘍出血性模型大鼠對潰瘍基底血管被侵蝕破裂出血后止血與促進潰瘍修復、愈合等作用進行初步觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SD大鼠130只，雌雄各半，6～8周齡，體質量(200±20)g，由北京維通利華實驗技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2012-0004。

1.1.2 藥物 熊膽粉(0.25 g/瓶×4瓶)(福建歸真堂藥業股份有限公司生產，國藥準字Z10980024)；熊去氧膽酸(上海生工生物工程股份有限公司生產，批號：BB07BA0324)；牛磺熊去氧膽酸(上海化成工業發展有限公司生產，批號：3MQWC-BP)；膽酸(美國Sigma公司生產，批號：SLBH1420V)止血紅花-8味散(內蒙古國際蒙醫醫院國家蒙藥制劑中心生產，呼衛制注字(97)001-133號)；吲哚美辛膠囊(消炎痛，湖北東信藥業有限公司生產，國藥準字H42021462)；奧美拉唑腸溶膠囊20 mg(石藥集團歐意藥業有限公司生產，國藥準字H20046430)。

1.1.3 試劑與儀器 5-HT ELISA KIT，規格：96T，產品編號：E02H0106；AngⅡ ELISA KIT，規格：96T，產品編號：E02A0204；VEGF ELISA KIT，規格：96T，產品編號：E02V0010；均由美國R&D公司生產。無水乙醇500 mL(天津市贏達稀貴化學試劑廠)；甲醛溶液500 mL(天津虔誠偉業科技發展有限公司)；超凈工作臺；電子天平；全自動多功能酶標儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)；水平離心機；MK3型酶標儀；電熱恒溫培養箱(DH4000A，天津泰斯特)；MINI shaker(MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER)；移液器；EP(0.1 mL，0.2 mL，1 mL)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 模型釆用吲哚美辛加無水乙醇法建立實驗性大鼠應激性胃潰瘍出血模型，將130只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、奧美拉唑組、止血紅花-8味散低和高劑量組、熊膽粉低和高劑量組、熊去氧膽酸(UDCA)低和高劑量組、牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)低和高劑量組、膽酸(CA)低和高劑量組，10只/組。

1.2.2 給藥方法 空白組和模型組灌胃等容積的0.9%氯化鈉注射液，止血紅花-8味散低劑量組270.1 mg/kg、止血紅花-8味散高劑量組539.9 mg/kg、熊膽粉及其主要成分低和高劑量組分別以45.7 mg/kg、91.5 mg/kg濃度的量每100 g大鼠1 mL的灌胃量灌胃(止血紅花-8味散由熊膽50 g、藏紅花50 g、菀豆花40 g、紅檀35 g、地錦草35 g、石斛35 g、制木鱉子25 g、朱砂25 g等8味藥組成。由止血，清熱，涼血功能。主治“寶日”病，胃腸出血，外傷流血，流鼻血，吐血，月經過多等多種出血癥。1～3次/d，1.5～3 g/次，溫開水送服。大鼠灌胃劑量為臨床給藥劑量按人的平均體質量70 kg計算，根據人和大鼠給藥劑量系數換算得出)；連續給藥7 d后，禁食24 h，胃出血造模用吲哚美辛(消炎痛)加乙醇法，ip消炎痛7.5 mg/mL，1 mL/100 g體質量，0.5 h后，觀察組分別灌胃相應藥物，1 mL/100 g體質量，空白組灌胃等容積的0.9%氯化鈉注射液，3 h后重復灌胃1次，第2次灌胃2.5 h后，模型組和觀察組再灌胃50%乙醇，1 mL/100 g體質量灌胃。

1.2.3 檢測指標與方法 末次給藥后1 h，用乙醚將大鼠致昏迷，背位固定，心臟穿刺取血5 mL，在室溫放置2 h后3 000 r/min離心10 min，取上清液得到待測血清。嚴格按照各個試劑盒說明書步驟操作，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法，測定血清5-HT、AngⅡ和VEGF的水平。

2 結果

2.1 蒙藥熊膽及主要成分對血小板計數的影響 空白組與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。模型組與空白組、奧美拉唑組、蒙藥熊膽及主要成分觀察組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。熊膽粉低和高劑量組、UDCA高劑量組、TUDCA低和高劑量組與奧美拉唑組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 蒙藥熊膽及主要成分對血小板計數的影響

注：與空白組比較*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與奧美拉唑組比較，▲P>0.05

2.2 蒙藥熊膽及主要成分對大鼠血清的影響 與空白組比較，5-HT其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)，AngⅡ除奧美拉唑組和UDCA高劑量組外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)，VEGF除奧美拉唑組和TUDCA高劑量組外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，5-HT其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)，AngⅡ除CA低劑量組外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)，VEGF除止血-8低劑量組、熊膽粉低劑量組、CA低劑量組和CA高劑量組外，其余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 空白組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)圖2 模型組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)

圖3 奧美拉唑組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)圖4 止血?8低組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)

圖7 熊膽粉高組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)圖8 UDCA低組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)

圖9 UDCA高組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)圖10 TUDCA低組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)

圖13 CA高組SD大鼠胃組織形態(HE，×20)

2.3 蒙藥熊膽及主要成分對胃組織病理學觀察 HE染色顯示，空白組大鼠胃壁組織在光鏡下可見黏膜層、黏膜下層、肌層及外模層結構連續、完整；黏膜層腺體排列緊密、整齊；上皮細胞形態正常、無炎性細胞浸潤、上皮脫落等表現。模型組大鼠黏膜層結構紊亂、胃腺體排列疏松、腺上皮細胞水腫，黏膜上皮缺失、片狀脫落、局部可見炎性細胞；固有層微血管充血、炎性細胞浸潤明顯；黏膜下層疏松水腫、可見炎性細胞滲出。觀察組大鼠胃黏膜層炎性細胞減少，平滑、肉芽的增生，有新生血管、固有膜上有新生修復的腺體，腺體的再生變得有規模。見圖1～13。

表2 蒙藥熊膽及主要成分對大鼠血清5-HT，AngⅡ，VEGF的影響

注：與空白組比較*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與奧美拉唑組比較，▲P>0.05

3 討論

胃潰瘍疾病在臨床上屬于常見病，出血是胃潰瘍最常見的并發癥。吲哚美辛(消炎痛)是易致胃潰瘍藥品中激素替代品類的一種，對胃黏膜有直接的損害作用，可引起胃炎、淺表潰瘍、急性胃潰瘍、十二指腸炎、胃腸黏膜糜爛而致出血，甚至穿孔。乙醇致大鼠胃潰瘍模型由19世紀Beaumont就已發現過度飲酒對胃黏膜有明顯損害作用[4]。乙醇濃度越高，乙醇灌胃后引起實驗動物胃黏膜上皮細胞的變性、壞死以及間質血管瘀血損傷會逐漸加重。乙醇可溶解脂肪的化合物，破壞胃黏膜屏障的脂蛋白層，保護性物質減少引起黏膜細胞損傷；乙醇可引起黏膜下血管內皮損傷，血管擴張、黏膜下出血等改變。陽性對照組藥奧美拉唑適用于胃潰瘍十二指腸潰瘍應激性潰瘍返流性食管炎和卓-艾綜合征(胃泌素瘤)，靜脈注射可用于消化性潰瘍急性出血的治療。

現代醫學認為的止血藥作用有收縮血管、降低毛細血管通透性，激活凝血因子，促進血小板生成黏附聚集，抗纖維蛋白溶解等主要4種。機體正常止血與凝血機制有賴于血管壁、血小板、凝血因子、抗凝因子、纖容系統以及他們之間的生理性調解和平衡[5]。

本研究中我們通過觀察蒙藥熊膽及主要成分對大鼠血小板、血清5-HT、AngⅡ及VEGF的影響初步了解到治療胃潰瘍出血性模型大鼠的作用機制。5-HT又稱血清素，其活性部分是吲哚胺。它廣泛存在于腦、血小板、胃等組織中，是較強的平滑肌和血管收縮劑。在血小板中含量較高，血小板破裂釋放后參與血管收縮等效益。促血管生成素(Ang)家族是近年來發現的與血管生成及血管成熟有關的因子，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一種多膚類激素，是腎素-血管緊張素系統的一種主要活性成分，以往僅被作為一種縮血管物質，目前己有很多試驗結果提示AngⅡ誘導的血管生成的作用機制可能是通過AT1R增加VEGF的產生，上調Ang-2的表達實現的[6-9]。VEGF是一種特異作用于血管內皮細胞，并能促進其有絲分裂的糖蛋白，能直接刺激血管內皮細胞的增殖作用，同時VEGF能增加血管通透能力，有利于血漿纖維蛋白外滲，進而促進血管生成達到止血目的。此外VEGF的促血管生成作用也有積極作用的一面，其在組織修復方面也有積極的作用。目前大量研究也證實VEGF在潰瘍修復中對潰瘍基底肉芽組織生長和新血管形成起到了重要的促進作用。說明VEGF確實參與了胃潰瘍的愈合過程，也進一步表明胃潰瘍愈合過程中需要形成微血管以便輸送氧和營養物質等，而VEGF可能在此過程中起了重要作用[10]。通過本實驗研究發現，蒙藥熊膽及主要成分UDCA、TUDCA能顯著提高血小板計數及降低血清5-HT、AngⅡ及VEGF水平，與模型組比較，差異有統計學意義，而CA作用較弱，表明蒙藥熊膽及主要成分UDCA、TUDCA是通過提高血小板計數、促進血管收縮而發揮止血作用。是降低毛細血管的通透性從而縮短凝血時間，或者直接作用于血管平滑肌，收縮毛細血管、小動脈、小靜脈，減少內臟血流量，促進血管破損處的血凝過程并形成凝塊，有利于血漿纖維蛋白外滲，進而促進血管生成達到止血作用。熊膽的主要成分UDCA、TUDCA的這種作用與熊膽基本相似，提示蒙藥熊膽的這種止血作用的主要成分為UDCA和TUDCA。本研究結果對于熊膽的科學、合理應用及從熊膽開發新藥提供科學依據。

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