女貞子酒制工藝響應曲面法的優化

劉艷紅 楊欣瀾

(陜西國際商貿學院，咸陽，712046)

女貞子系木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實，始載于《神農本草經》，列為上品。其性味甘、苦、涼，歸肝、腎經。具有滋腎補肝，明目烏發的功能。常用于治療眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發早白，目暗不明等癥[1]，現代研究表明，女貞子提取物具有降血糖、抗氧化作用，其提取物對糖尿病大鼠肝損傷具有一定保護作用[2-4]，以上發現將為擴大女貞子的臨床應用提供一定的依據。

女貞子的炮制方法始見于宋代·《瘡瘍》一書，隨著歷史的發展，炮制方法不斷增加，沿用至今。現在女貞子的炮制方法，除了凈制、蒸制、酒制、鹽制外，還有醋制，全國各地的炮制規范中收載的大多是酒制[5]。1963和1977年版《中華人民共和國藥典》均收載為酒燉法，1985—2015年版《中華人民共和國藥典》收載為酒燉法或酒蒸法，用酒量為每100 kg女貞子用酒20 kg[6]。

查閱文獻及各地炮制規范，發現關于女貞子的炮制的方法及工藝各地各法，悶潤時間、蒸制時間的工藝參數也不完備。目前，女貞子藥材主要采用酒制，炮制過程中在藥材是否悶潤、蒸制時間及蒸制溫度上，2015版《中華人民共和國藥典》和全國各省市的中藥飲片炮制規范，均沒有明確規定，即便是有規定，參數也不統一，各地各法[7-11]，如此情況飲片質量必然受到影響，飲片的優劣，直接影響著中醫治病的療效[12]，因此，規范女貞子酒制工藝意義重大。本實驗中，選取評價指標為女貞子酒制品中齊墩果酸的含量[13]，采用Box-Behnken優化女貞子酒制工藝，確定最佳的酒制工藝參數，為飲片炮制工藝及藥材質量的可控性提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀(Waters科技上海有限公司)，TE124S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，CP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，FW-100D高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限責任公司)，KQ-A玻璃儀器氣流烘干機(北京中興偉業儀器有限公司)，KH5200DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 齊墩果酸對照品(購于食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206)；氯仿、甲醇、磷酸溶液等其他試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.3 分析樣品 女貞子(采摘于陜西國際商貿學院，經生藥教研室雷國蓮教授鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.1%H3PO4溶液梯度洗脫(0～5 min 85∶15；5～14.5 min 90∶10；14.5～18 min 91∶9；18～25 min 95∶5)，流速為1 mL/min，測定波長210 nm，柱溫25 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品13.07 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.522 8 mg/ mL對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取經干燥、粉碎后過60目篩的女貞子粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加氯仿25 mL，稱重，超聲波處理30 min，取出，放冷，再稱重，用氯仿補足減失的質量，搖勻，過濾，即得。

2.4 齊墩果酸標準曲線的繪制 取0.522 8 mg/mL的對照品溶液，分別進樣2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、16 μL、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積(A)對齊墩果酸進樣量(μg)進行線性回歸，回歸方程為y=573 784x+55 174(R2=0.999 5)，表明齊墩果酸在1.05～10.46 μg范圍內具有良好的線性關系。標準曲線見圖1。

圖1 齊墩果酸的標準曲線

2.5 單因素考察 黃酒用量、悶潤時間和蒸制時間3個因素對齊墩果酸含量的影響[14-15]。

2.5.1 黃酒用量對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，分別加入藥材量15%、20%、25%、30%、35%、40%的黃酒，悶潤1 h，蒸制3 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。黃酒用量為15%～25%內時，隨著黃酒用量的增加，炮制品中齊墩果酸含量增加，但隨著黃酒用量繼續增加，炮制品中齊墩果酸含量反而降低，這可能是因為隨著黃酒用量的增加，藥材會出現傷水，齊墩果酸流失。見圖2。

圖2 黃酒用量對齊墩果酸含量的影響

2.5.2 悶潤時間對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，加入藥材量25%的黃酒，分別悶潤時間1、2、3、4、5 h，蒸制時間3 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。悶潤時間為1～3 h內時，隨著悶潤時間的延長，炮制品中齊墩果酸含量增加，但隨著悶潤時間繼續增加，炮制品中齊墩果酸含量基本不變，考慮節約時間選擇悶潤時間為3 h。見圖3。

圖3 悶潤時間對齊墩果酸含量的影響

2.5.3 蒸制時間對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，加入藥材量25%的黃酒，悶潤時間3 h，蒸制時間1、3、5、7、9 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。蒸制時間為1～5 h內時，隨著蒸制時間的延長，炮制品中齊墩果酸含量增加，說明蒸制過程有利于齊墩果酸的溶出，但隨著蒸制時間繼續增加，炮制品中齊墩果酸含量基本不變或略有下降，可能隨著蒸制時間延長有些成分分解。見圖4。

2.6 響應曲面優化

2.6.1 響應曲面優選分析 在單因素的實驗的基礎上，根據Box-Behnken的設計原理，選擇黃酒用量、悶潤時間以及蒸制時間為實驗的影響因素，以齊墩果酸含量為響應值，采用三因素三水平進行實驗結果分析。在單因素實驗的基礎上，根據因素水平表1，按照響應曲面Box-Behnken的設計原理，共有17組實驗，其實驗結果如下表2～3。

圖4 蒸制時間對齊墩果酸含量的影響

編號黃酒用量(%)悶潤時間(h)蒸制時間(h)1304702535-12023

表2 實驗設計及實驗結果

通過Design-Expert8.0.6軟件對所得數據進行多元回歸擬合，得到齊墩果酸含量(Y)對女貞子炮制中黃酒用量(X1)，悶潤時間(X2)，蒸制時間(X3)的二次多元回歸方程是：Y=1.65+0.044X1+0.024X2+0.039X3-0.16X1X2-0.16X1X3-0.021X2X3-0.28X12-0.13X22-0.19X32。

回歸方程的R2=0.985 1，表明實驗值與預測值有很好的擬合度。且失擬項不顯著，表明方程的模擬好，可以采用這種方法對女貞子的酒制工藝進行預測和分析。從回歸方程顯著性檢查結果顯示：回歸方程的一次項中，黃酒用量(X1)、蒸制時間(X3)對齊墩果酸含量的影響顯著，而悶潤時間的一次項不顯著；在交互項中，黃酒用量和悶潤時間(X1X2)、黃酒用量和蒸制時間(X1X3)的交互項具有非常顯著影響，其他無顯著性；二次項中，黃酒用量(X12)、悶潤時間(X22)、蒸制時間(X32)均具有非常顯著性。在各個因素的水平中，對齊墩果酸含量影響結果由大到小的順序為黃酒用量(X1)>蒸制時間(X3)>悶潤時間(X2)。見表3。

表3 方差分析表

2.6.2 響應曲面圖譜與分析 根據模型方程繪制的響應曲面圖與等高線圖見圖5～7。從圖5～7可以直觀地看出三因素的最佳參數及各因素之間的交互作用。圖5表示黃酒用量以及悶潤時間及其交互作用對齊墩果酸含量的影響，從圖中可見，黃酒用量曲面較陡峭，說明黃酒用量對齊墩果酸含量的影響較顯著，悶潤時間的曲面較平緩，說明悶潤時間對齊墩果酸含量的影響不明顯[16]。等高線圖為橢圓形，說明黃酒用量和悶潤時間的交互項對齊墩果酸含量影響顯著。黃酒用量和蒸制時間對齊墩果酸含量的影響見圖6，黃酒用量和蒸制時間曲面均較陡峭，說明黃酒用量和蒸制時間對齊墩果酸含量的影響較顯著，等高線圖為橢圓形，說明黃酒用量和蒸制時間的交互項對齊墩果酸含量影響顯著。圖7為悶潤時間與蒸制時間對齊墩果酸含量的響應曲面圖，由圖可以看出當黃酒用量一定時，齊墩果酸含量都是隨著悶潤時間與蒸制時間的增加呈現先增加后降低的趨勢，悶潤時間與蒸制時間的坡面都較陡，則說明它們的二次項對齊墩果酸含量的影響都比較顯著。等高線趨于橢圓，但不明顯，說明悶潤時間與蒸制時間的交互項對齊墩果酸含量的影響不顯著。

根據實驗設計所得出的結果以及二次回歸模型的數學分析結果，使用Design-Expert 8.0.6軟件計算可得到女貞子酒制工藝的炮制條件為黃酒用量25.19%，悶潤時間3.06 h，蒸制時間5.16 h，齊墩果酸含量的理論值為1.650 35%。

為了驗證響應曲面法所得結果以及其可實施性，通過實驗對優化后炮制工藝條件進行確定。對最佳提取工藝的參數而進行調整，達到方便操作的要求，最終工藝條件調整為黃酒用量25%，悶潤時間3.1 h，蒸制時間5.2 h。在此條件做3次平行實驗，得到齊墩果酸的平均含量為1.64%。本實驗研究為進一步有效、合理的對女貞子藥材進行酒制提供參考依據，將在一定程度上保證女貞子炮制品品質的穩定性。

圖5 黃酒用量與悶潤時間的響應曲面圖和等高線圖

圖6 黃酒用量與蒸制時間的響應曲面圖和等高線圖

圖7 悶潤時間與蒸制時間的響應曲面圖和等高線圖

2.7 結果分析 本實驗通過響應曲面法考察了黃酒用量、悶潤時間、蒸制時間對女貞子炮制品中齊墩果酸含量的影響。二次方程的模型回歸差異極顯著，且二次方差分析后的失擬項檢驗不顯著，說明本實驗所建立的二次回歸方程正確反映了所考察因素與響應值之間的關系，試驗設計科學合理；利用回歸模型對影響齊墩果酸含量的關鍵因素及其相互作用進行了探討；通過工藝條件的優化得到女貞子的酒制最佳炮制工藝條件為黃酒用量25.19%，悶潤時間3.06 h，蒸制時間5.16 h，在此條件下，齊墩果酸含量的理論值為1.650 35%。為了方便操作，對最佳提取工藝的參數進行調整，最終工藝條件調整為黃酒用量25%，悶潤時間3.1 h，蒸制時間5.2 h。在此條件做3次平行實驗，得到齊墩果酸的平均含量為1.64%，相對誤差為0.63%，與預測值接近。

3 討論

本實驗在建立HPLC法測定女貞子中齊墩果酸的含量測定方法過程中，為了使齊墩果酸和女貞子中其他成分良好分離，探索采用了梯度洗脫的方法，最終使齊墩果酸與其他成分實現了較好的分離。

炮制工藝優化傳統上有正交實驗和均勻試驗等較為常用，傳統優化方法雖然試驗次數少，但精密性差[17]，不能完全作為大生產的參考。響應曲面法能把因素與響應值的相互關系函數化，建立連續變量曲面模型，對各因素進行了全面的優化研究，比正交試驗設計更直觀、精確地得到最優組合條件[18-19]。由此得到更優的女貞子炮制工藝條件，為女貞子藥材質量和品質的可控性提供保證。因此，該炮制方法可以在女貞子的炮制工藝研究及生產中推廣應用。

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