女貞子酒制工藝響應(yīng)曲面法的優(yōu)化

劉艷紅 楊欣瀾

(陜西國際商貿(mào)學院，咸陽，712046)

女貞子系木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。其性味甘、苦、涼，歸肝、腎經(jīng)。具有滋腎補肝，明目烏發(fā)的功能。常用于治療眩暈耳鳴，腰膝酸軟，須發(fā)早白，目暗不明等癥[1]，現(xiàn)代研究表明，女貞子提取物具有降血糖、抗氧化作用，其提取物對糖尿病大鼠肝損傷具有一定保護作用[2-4]，以上發(fā)現(xiàn)將為擴大女貞子的臨床應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

女貞子的炮制方法始見于宋代·《瘡瘍》一書，隨著歷史的發(fā)展，炮制方法不斷增加，沿用至今。現(xiàn)在女貞子的炮制方法，除了凈制、蒸制、酒制、鹽制外，還有醋制，全國各地的炮制規(guī)范中收載的大多是酒制[5]。1963和1977年版《中華人民共和國藥典》均收載為酒燉法，1985—2015年版《中華人民共和國藥典》收載為酒燉法或酒蒸法，用酒量為每100 kg女貞子用酒20 kg[6]。

查閱文獻及各地炮制規(guī)范，發(fā)現(xiàn)關(guān)于女貞子的炮制的方法及工藝各地各法，悶潤時間、蒸制時間的工藝參數(shù)也不完備。目前，女貞子藥材主要采用酒制，炮制過程中在藥材是否悶潤、蒸制時間及蒸制溫度上，2015版《中華人民共和國藥典》和全國各省市的中藥飲片炮制規(guī)范，均沒有明確規(guī)定，即便是有規(guī)定，參數(shù)也不統(tǒng)一，各地各法[7-11]，如此情況飲片質(zhì)量必然受到影響，飲片的優(yōu)劣，直接影響著中醫(yī)治病的療效[12]，因此，規(guī)范女貞子酒制工藝意義重大。本實驗中，選取評價指標為女貞子酒制品中齊墩果酸的含量[13]，采用Box-Behnken優(yōu)化女貞子酒制工藝，確定最佳的酒制工藝參數(shù)，為飲片炮制工藝及藥材質(zhì)量的可控性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters E2695高效液相色譜儀(Waters科技上海有限公司)，TE124S分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，CP225D電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)，F(xiàn)W-100D高速萬能粉碎機(天津鑫博得儀器有限責任公司)，KQ-A玻璃儀器氣流烘干機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，KH5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑 齊墩果酸對照品(購于食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206)；氯仿、甲醇、磷酸溶液等其他試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

1.3 分析樣品 女貞子(采摘于陜西國際商貿(mào)學院，經(jīng)生藥教研室雷國蓮教授鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.1%H3PO4溶液梯度洗脫(0～5 min 85∶15；5～14.5 min 90∶10；14.5～18 min 91∶9；18～25 min 95∶5)，流速為1 mL/min，測定波長210 nm，柱溫25 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酸對照品13.07 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成濃度為0.522 8 mg/ mL對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取經(jīng)干燥、粉碎后過60目篩的女貞子粉末0.5 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加氯仿25 mL，稱重，超聲波處理30 min，取出，放冷，再稱重，用氯仿補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，即得。

2.4 齊墩果酸標準曲線的繪制 取0.522 8 mg/mL的對照品溶液，分別進樣2 μL、4 μL、8 μL、10 μL、16 μL、20 μL，按上述色譜條件測定峰面積。以峰面積(A)對齊墩果酸進樣量(μg)進行線性回歸，回歸方程為y=573 784x+55 174(R2=0.999 5)，表明齊墩果酸在1.05～10.46 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。標準曲線見圖1。

圖1 齊墩果酸的標準曲線

2.5 單因素考察 黃酒用量、悶潤時間和蒸制時間3個因素對齊墩果酸含量的影響[14-15]。

2.5.1 黃酒用量對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，分別加入藥材量15%、20%、25%、30%、35%、40%的黃酒，悶潤1 h，蒸制3 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。黃酒用量為15%～25%內(nèi)時，隨著黃酒用量的增加，炮制品中齊墩果酸含量增加，但隨著黃酒用量繼續(xù)增加，炮制品中齊墩果酸含量反而降低，這可能是因為隨著黃酒用量的增加，藥材會出現(xiàn)傷水，齊墩果酸流失。見圖2。

圖2 黃酒用量對齊墩果酸含量的影響

2.5.2 悶潤時間對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，加入藥材量25%的黃酒，分別悶潤時間1、2、3、4、5 h，蒸制時間3 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。悶潤時間為1～3 h內(nèi)時，隨著悶潤時間的延長，炮制品中齊墩果酸含量增加，但隨著悶潤時間繼續(xù)增加，炮制品中齊墩果酸含量基本不變，考慮節(jié)約時間選擇悶潤時間為3 h。見圖3。

圖3 悶潤時間對齊墩果酸含量的影響

2.5.3 蒸制時間對齊墩果酸含量的影響 精密稱取女貞子25 g，加入藥材量25%的黃酒，悶潤時間3 h，蒸制時間1、3、5、7、9 h，取出，攤于瓷盤中，烘箱中50 ℃烘干，取出，放涼，粉碎，按上述制樣和色譜方法測定其中齊墩果酸含量。蒸制時間為1～5 h內(nèi)時，隨著蒸制時間的延長，炮制品中齊墩果酸含量增加，說明蒸制過程有利于齊墩果酸的溶出，但隨著蒸制時間繼續(xù)增加，炮制品中齊墩果酸含量基本不變或略有下降，可能隨著蒸制時間延長有些成分分解。見圖4。

2.6 響應(yīng)曲面優(yōu)化

2.6.1 響應(yīng)曲面優(yōu)選分析 在單因素的實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的設(shè)計原理，選擇黃酒用量、悶潤時間以及蒸制時間為實驗的影響因素，以齊墩果酸含量為響應(yīng)值，采用三因素三水平進行實驗結(jié)果分析。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)因素水平表1，按照響應(yīng)曲面Box-Behnken的設(shè)計原理，共有17組實驗，其實驗結(jié)果如下表2～3。

圖4 蒸制時間對齊墩果酸含量的影響

編號黃酒用量(%)悶潤時間(h)蒸制時間(h)1304702535-12023

表2 實驗設(shè)計及實驗結(jié)果

通過Design-Expert8.0.6軟件對所得數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到齊墩果酸含量(Y)對女貞子炮制中黃酒用量(X1)，悶潤時間(X2)，蒸制時間(X3)的二次多元回歸方程是：Y=1.65+0.044X1+0.024X2+0.039X3-0.16X1X2-0.16X1X3-0.021X2X3-0.28X12-0.13X22-0.19X32。

回歸方程的R2=0.985 1，表明實驗值與預(yù)測值有很好的擬合度。且失擬項不顯著，表明方程的模擬好，可以采用這種方法對女貞子的酒制工藝進行預(yù)測和分析。從回歸方程顯著性檢查結(jié)果顯示：回歸方程的一次項中，黃酒用量(X1)、蒸制時間(X3)對齊墩果酸含量的影響顯著，而悶潤時間的一次項不顯著；在交互項中，黃酒用量和悶潤時間(X1X2)、黃酒用量和蒸制時間(X1X3)的交互項具有非常顯著影響，其他無顯著性；二次項中，黃酒用量(X12)、悶潤時間(X22)、蒸制時間(X32)均具有非常顯著性。在各個因素的水平中，對齊墩果酸含量影響結(jié)果由大到小的順序為黃酒用量(X1)>蒸制時間(X3)>悶潤時間(X2)。見表3。

表3 方差分析表

2.6.2 響應(yīng)曲面圖譜與分析 根據(jù)模型方程繪制的響應(yīng)曲面圖與等高線圖見圖5～7。從圖5～7可以直觀地看出三因素的最佳參數(shù)及各因素之間的交互作用。圖5表示黃酒用量以及悶潤時間及其交互作用對齊墩果酸含量的影響，從圖中可見，黃酒用量曲面較陡峭，說明黃酒用量對齊墩果酸含量的影響較顯著，悶潤時間的曲面較平緩，說明悶潤時間對齊墩果酸含量的影響不明顯[16]。等高線圖為橢圓形，說明黃酒用量和悶潤時間的交互項對齊墩果酸含量影響顯著。黃酒用量和蒸制時間對齊墩果酸含量的影響見圖6，黃酒用量和蒸制時間曲面均較陡峭，說明黃酒用量和蒸制時間對齊墩果酸含量的影響較顯著，等高線圖為橢圓形，說明黃酒用量和蒸制時間的交互項對齊墩果酸含量影響顯著。圖7為悶潤時間與蒸制時間對齊墩果酸含量的響應(yīng)曲面圖，由圖可以看出當黃酒用量一定時，齊墩果酸含量都是隨著悶潤時間與蒸制時間的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，悶潤時間與蒸制時間的坡面都較陡，則說明它們的二次項對齊墩果酸含量的影響都比較顯著。等高線趨于橢圓，但不明顯，說明悶潤時間與蒸制時間的交互項對齊墩果酸含量的影響不顯著。

根據(jù)實驗設(shè)計所得出的結(jié)果以及二次回歸模型的數(shù)學分析結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6軟件計算可得到女貞子酒制工藝的炮制條件為黃酒用量25.19%，悶潤時間3.06 h，蒸制時間5.16 h，齊墩果酸含量的理論值為1.650 35%。

為了驗證響應(yīng)曲面法所得結(jié)果以及其可實施性，通過實驗對優(yōu)化后炮制工藝條件進行確定。對最佳提取工藝的參數(shù)而進行調(diào)整，達到方便操作的要求，最終工藝條件調(diào)整為黃酒用量25%，悶潤時間3.1 h，蒸制時間5.2 h。在此條件做3次平行實驗，得到齊墩果酸的平均含量為1.64%。本實驗研究為進一步有效、合理的對女貞子藥材進行酒制提供參考依據(jù)，將在一定程度上保證女貞子炮制品品質(zhì)的穩(wěn)定性。

圖5 黃酒用量與悶潤時間的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖6 黃酒用量與蒸制時間的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

圖7 悶潤時間與蒸制時間的響應(yīng)曲面圖和等高線圖

2.7 結(jié)果分析 本實驗通過響應(yīng)曲面法考察了黃酒用量、悶潤時間、蒸制時間對女貞子炮制品中齊墩果酸含量的影響。二次方程的模型回歸差異極顯著，且二次方差分析后的失擬項檢驗不顯著，說明本實驗所建立的二次回歸方程正確反映了所考察因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，試驗設(shè)計科學合理；利用回歸模型對影響齊墩果酸含量的關(guān)鍵因素及其相互作用進行了探討；通過工藝條件的優(yōu)化得到女貞子的酒制最佳炮制工藝條件為黃酒用量25.19%，悶潤時間3.06 h，蒸制時間5.16 h，在此條件下，齊墩果酸含量的理論值為1.650 35%。為了方便操作，對最佳提取工藝的參數(shù)進行調(diào)整，最終工藝條件調(diào)整為黃酒用量25%，悶潤時間3.1 h，蒸制時間5.2 h。在此條件做3次平行實驗，得到齊墩果酸的平均含量為1.64%，相對誤差為0.63%，與預(yù)測值接近。

3 討論

本實驗在建立HPLC法測定女貞子中齊墩果酸的含量測定方法過程中，為了使齊墩果酸和女貞子中其他成分良好分離，探索采用了梯度洗脫的方法，最終使齊墩果酸與其他成分實現(xiàn)了較好的分離。

炮制工藝優(yōu)化傳統(tǒng)上有正交實驗和均勻試驗等較為常用，傳統(tǒng)優(yōu)化方法雖然試驗次數(shù)少，但精密性差[17]，不能完全作為大生產(chǎn)的參考。響應(yīng)曲面法能把因素與響應(yīng)值的相互關(guān)系函數(shù)化，建立連續(xù)變量曲面模型，對各因素進行了全面的優(yōu)化研究，比正交試驗設(shè)計更直觀、精確地得到最優(yōu)組合條件[18-19]。由此得到更優(yōu)的女貞子炮制工藝條件，為女貞子藥材質(zhì)量和品質(zhì)的可控性提供保證。因此，該炮制方法可以在女貞子的炮制工藝研究及生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。

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