三種抗菌藥物對羊源大腸桿菌抗菌活性的研究

邵莉萍+李宏勝+妥鑫

摘要：采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC），研究抗菌藥物恩諾沙星、環丙沙星、加替沙星對21株羊源大腸桿菌臨床分離株的體外抗菌活性，從而觀察大腸桿菌對幾類抗菌藥物的敏感性。結果表明，大腸桿菌對恩諾沙星、環丙沙星、加替沙星的敏感率分別為0.00、66.7%、61.9%，耐藥率分別為47.6%、14.3%、33.3%。恩諾沙星、環丙沙星、加替沙星均對大腸桿菌產生不同程度的耐藥性，其中恩諾沙星耐藥性最強，而環丙沙星耐藥性最弱。

關鍵詞：恩諾沙星；加替沙星；環丙沙星；大腸桿菌；耐藥性：敏感性

中圖分類號：S859.79+6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）01-0086-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.022

Abstract： The broth microdilution method is used to determine MIC，which aims to evaluate the activity of the Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin against the clinical Escherichia coli from sheeps（21 isolates），and the susceptible and resistance of the enrofloxacin，gatifloxacin and ciprofloxacin against E.coli was estimated. Result showed that，drugs susceptiblerates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 0.00，66.7%，61.9%， and the drugs resistance rates to Enrofloxacin，Ciprofloxacin and Gatifloxacin in E.coli are 47.6%，14.3%，33.3%. Enrofloxacin，Ciprofloxacin，Gatifloxacin emerge the different resistantance to E.coil. The E.coil strains showed high drug resistance to Enrofloxacin，and showed low drug resistance to Ciprofloxacin.

Key words： Enrofloxacin； Gatifloxacin； Ciprofloxacin； Escherichia coli； drug resistance； sensibility

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）俗稱大腸桿菌，屬埃希氏菌屬（Escherichia），為人和動物腸道中的正常菌群之一。但是，在一定條件下，某些血清型的大腸桿菌會隨著動物機體抵抗力低下而引起動物患病，特別是對于嬰兒或者幼畜，常常引起嚴重腹瀉和敗血癥[1]。E.coli作為食源性疾病的主要致病菌之一，不僅在發展中國家常發，發達國家也不例外，許多國家曾經都對其進行過相關的報道[2]。它常常伴隨著動物的屠宰加工或者奶制品的原料采集和生產等過程進行感染，大量的數據證實食品動物和奶制品是致病性大腸桿菌（Diarrheagenic E. Coli，DEC）傳播并導致人類或者動物發病的主要媒介，例如牛肉、豬肉、羊肉以及家禽肉，其肉制品或者奶制品攜帶DEC的概率大概為2.84%和0.75%[3]。

羊腹瀉是羊養殖行業常見的腸道疾病之一，其主要致病菌之一為E.coil。羔羊作為易感群體，常常大規模發病，腹瀉嚴重時，死亡率高達50%，給畜牧養殖行業造成巨大的經濟損失[4，5]。但是，由于抗菌藥物大量的濫用，使得羊源大腸桿菌產生耐藥性，并且其耐藥性逐年在增強。近幾年，大腸桿菌的多重耐藥菌株和交叉耐藥菌株在臨床上多次被分離和報道，尤其對青霉素和紅霉素的耐藥性可達到90%以上[6]。喹諾酮類化合物是一類人工合成的含4-喹諾酮基本結構的抗菌劑，對革蘭氏陰性菌具有良好的抗菌活性和較強的藥代學特性，自20世紀60年代問世以來，已經經歷4代的結構改造與修飾，目前獸醫臨床常用的為第三代的環丙沙星（Ciprofloxacin）和恩諾沙星（Enrofloxacin）以及第四代的加替沙星（Gatifloxacin），其中恩諾沙星在獸醫臨床中應用最為廣泛[7，8]。但是，自2000年以來，獸醫臨床上常見致病菌對喹諾酮類藥物產生耐藥性的現象在疾病的治療中越發普遍，特別是腸道大腸桿菌的耐藥性問題。為此，本文通過研究21株羊源大腸桿菌臨床分離菌對喹諾酮類藥物恩諾沙星、加替沙星、環丙沙星的耐藥性，為獸醫臨床合理用藥提供數據支持，從而避免臨床大腸桿菌耐藥問題的進一步惡化。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

恩諾沙星，純度98%，由北京索萊寶科技有限公司提供；環丙沙星、加替沙星，純度均為98%，均由上海麥克林生化科技有限公司提供。

CAMHB培養基購自青島海博生物技術有限公司，新生牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.2 菌株

羊源大腸桿菌臨床分離株21株，分離于甘肅省臨夏某牛場；質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC 29213、糞腸球菌ATCC 29212，均購自美國組織培養庫（ATCC）。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養基的配制 將液體培養基CAMHB按照產品要求配制一定體積的培養液，高壓滅菌之后，置于4 ℃冰箱備用。endprint

1.3.2 抗菌藥液的制備 試驗前精密稱取恩諾沙星、環丙沙星、加替沙星，無菌操作配制成2 048 μg/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存備用，臨用前用相應的細菌培養液稀釋至試驗需要濃度。恩諾沙星、加替沙星用去離子水作溶劑，振蕩30 min；環丙沙星用甲醇作溶劑，振蕩30 min。

1.3.3 標準菌液制備 打開超凈工作臺，用無菌接種環挑取1個單菌落，接種至CAMHB液體培養基中，于37 ℃振蕩培養5 h后，用無菌CAMHB培養基稀釋菌液，直至菌液濃度為1×108 CFU/mL。

1.4 最小抑菌濃度（MIC）的測定

采用微量肉湯稀釋法分別測定待測藥物對每株菌株的MIC，試驗參考標準為美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）[9，10]。將一定濃度的待測藥物倍比稀釋到96孔板各試驗孔中，稀釋梯度為13個梯度，濃度范圍為0.0625～256 μg/mL。然后用無菌CAMHB培養液稀釋已調節至1×108 CFU/mL濃度的菌液，稀釋后的菌液在15 min內完成接種，保證每孔細菌的終濃度為5×105 CFU/mL，以及保證每孔對應的藥物濃度分別為相應的13個梯度所對應的濃度。陰性對照組為接種了細菌的細菌培養液。當陰性對照組長出細菌時，試驗結果方可采納。

2 結果與分析

藥物對21株羊源大腸桿菌的MIC結果見表1和表2。試驗結果表明，恩諾沙星和環丙沙星的MIC50值相同，均為2 μg/mL，加替沙星的MIC50值略低于恩諾沙星和環丙沙星，為1 μg/mL，對于MIC90，除了環丙沙星為2 μg/mL之外，加替沙星和恩諾沙星相同，其值為≥32 μg/mL。

藥物對21株羊源大腸桿菌的耐藥率（Resistance）與敏感率（Susceptible）結果見表3。試驗結果表明，羊源大腸桿菌對環丙沙星最敏感（66.7%），耐藥率（14.3%）最低。對于加替沙星和恩諾沙星，羊源大腸桿菌對恩諾沙星不敏感（0.00），耐藥性也是喹諾酮類藥物當中最高的，為47.6%；對加替沙星的耐藥率為33.3%，敏感率為61.9%。

3 小結與討論

試驗結果表明，喹諾酮類藥物恩諾沙星對羊源大腸桿菌的耐藥性最顯著，為47.6%，并且對E. Coli不敏感；而環丙沙星對羊源大腸桿菌最敏感，其敏感率為66.7%，而耐藥性僅為14.3%。由此可以發現，甘肅省臨夏一帶的羊源E. Coli對環丙沙星仍然具有一定的敏感性，對恩諾沙星卻已經產生一定程度的耐藥性。但是其他省份和地區有關大腸桿菌對喹諾酮類藥物的耐藥性和敏感性報道卻與本試驗結果并不一致，說明大腸桿菌的耐藥性呈現一定的區域特性。

由于大腸桿菌在中國各個地區均呈現出嚴重的耐藥現狀，且表現出地區差異性，耐藥基因可以通過質粒水平進行傳染，從而給養殖行業帶來嚴重威脅。因此，為防止大腸桿菌耐藥情形進一步擴大蔓延和加重，應該采取有效措施進行應對，比如聯合科研機構根據大腸桿菌不同耐藥機理進行新藥創制，或者積極向相關部門反映情況，引起其重視，從而采取相應措施來加強耐藥菌的檢測，以減少更多耐藥情況的惡化。

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