柚子皮中的總黃酮提取工藝研究

鄭培君+程海濤+王小博

摘要：以乙醇作為浸提劑，利用響應曲面法探討柚子皮總黃酮的最佳提取工藝條件。結果表明，提取溫度為70 ℃，液料比為20∶1（mL∶g）、乙醇體積分數為80%、提取時間為1.5 h，所得的柚子皮中的總黃酮含量最高，為0.864%。

關鍵詞：柚子皮；響應曲面法；總黃酮；提取工藝

中圖分類號：S666.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）01-0104-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.01.027

Abstract： The optimum extracting parameters were investigated with response surface methodology with alcohol as the extraction agent. The results showed that the extracting rate of total flavonoids reached 0.864% at the optimal processing conditions when extraction temperature was 70 ℃，the ratio of extractant to material was 20∶1（mL∶g），volume percent of alcohol was 80%，and extraction time was 1.5 h.

Key words： pommel peel；response surface methodology；total flavonoids；extract process

黃酮類化合物是一類具有C6C3C6骨架的2-苯基色原酮或色原烷的衍生物[1]。柚子皮中含有豐富的黃酮類物質，通常在植物中與糖結合成苷，主要由柚皮苷、橙皮苷、柚皮素蕓香苷等二氫黃酮類化合物構成，其中柚皮苷含量占80%以上[2]。黃酮類化合物具有多種生物活性和藥用價值，如抗氧化、抗腫瘤、消炎、鎮痛、抗菌、降低血液黏度、減少血脂和血栓的形成、防治胃潰瘍等[3-6]。在食品工業上，可作為天然的食品添加劑、食用色素、風味改良劑和苦味劑[7]，又可合成高甜度、無毒、低能量的柚皮苷二氫查爾酮和新橙皮甙二氫查爾酮。此外，柚皮苷還可以用作合成檸檬素、鼠李糖等具有較高的藥用價值的原材料[8]。長期以來，柚子主要用來鮮食，而占柚果總重量高達20%～30%的果皮，大多數作為廢物被丟棄，既浪費資源又污染環境。從柚子皮中提取黃酮類物質可以有效開發利用柚子資源，對提高柚子產業的附加值具有重要意義。本研究應用乙醇浸提法，通過單因素試驗和響應面優化，得出了柚子皮總黃酮提取的最佳工藝參數，以期為柚子產業開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 馬家柚，由江西瀛洲農業科技發展有限公司提供。蘆丁標準品（生化試劑），乙醇、甲醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯甲烷（均為分析純），均購自廣州齊云化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備 HH-4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市華城開元實驗儀器廠）；722 N型可見分光光度計（上海奧譜勒儀器有限公司）；SHZ-CB型循環水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；JJ200 B型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；RV 10型旋轉蒸發器（德國IKA集團）。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品15.0 mg，加甲醇溶解并定容100 mL，得到濃度為150 μg/mL的蘆丁標準溶液。分別準確吸取蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL移入10 mL具塞刻度試管中，先加30%乙醇溶液至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%Al（OH）3溶液0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入1.0 mol/L NaOH溶液2 mL，再用30%乙醇溶液定容至刻度，充分振蕩后放置30 min。以30%乙醇為空白，用1 cm比色杯在波長510 nm下測定吸光度[9]。

1.2.2 黃酮類物質的提取 將柚子清洗除雜后，剝取其果皮，柚子皮經過挑選清洗，切割成1 cm2的小塊，置于70 ℃的烘箱中干燥10 h，用小型高速粉碎機將其粉碎過100目篩。精確稱取2.5 g制備好的柚皮粉，置于錐形瓶中。按照張怡等[10]的方法提取后作為待測液。

1.2.3 總黃酮的檢測 用移液管吸取1 mL待測液，按標準曲線指標操作步驟于波長510 nm處進行吸光度測定。通過吸光度的測定，根據以下公式算出樣品中總黃酮提取率[10]。重復3次，取平均值。

總黃酮提取率：X=（M1V2/MV1）×10-6。式中，M1為依據標準曲線計算出被測液中總黃酮的含量（μg）；M為試樣的質量（g）；V1為待測液分取的體積（mL）；V2為待測液的總體積（mL）。

1.2.4 單因素試驗

1）提取溫度的選擇。固定液料比為20∶1（mL∶g，下同），乙醇體積分數為70%，提取時間為2 h的提取條件下，在提取溫度為60、70、80、90、100 ℃時，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

2）液料比的選擇。固定提取溫度為70 ℃，乙醇體積分數為70%，提取時間為2 h的提取條件下，液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL∶g，下同）時，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

3）乙醇體積分數的選擇。固定提取溫度為70 ℃，液料比為20∶1，提取時間為2 h的提取條件下，乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、80%、90%時，測定柚子皮中的總黃酮提取率。endprint

4）提取時間的選擇。固定提取溫度為70 ℃，乙醇體積分數為70%，液料比為20∶1的提取條件下，提取時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時，測定柚子皮中的總黃酮提取率。

1.2.5 響應面優化 在單因素試驗結果基礎上，采用Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設計原則設計試驗，并對提取條件進行優化。選取提取溫度、液料比、乙醇體積分數、提取時間4個因素作為試驗因素，總黃酮提取率為響應值。

1.3 數據統計分析

采用SPSS19.0軟件對試驗數據進行統計分析，采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖1可知，在70 ℃，柚子皮總黃酮提取率最高，當溫度大于70 ℃時，提取率反而呈下降趨勢。這是因為隨著溫度的增加，可溶性成分的溶解度和擴散系數增大，有利于浸提；但過高的溫度，會破壞不耐熱的活性成分，降低柚子皮總黃酮的提取率；此外，溫度較高時乙醇揮發嚴重，也會降低總黃酮提取率[11]。因此，初步確定70 ℃為最佳的浸提溫度。

2.1.2 液料比對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖2可以看出，隨著液料比的增大，總黃酮提取率增加，20∶1時最大。這是因為隨著溶劑的增多，增加了柚子皮粉與溶劑的接觸面積，提高了傳質效率[11]。但當液料比大于20∶1時，總黃酮提取率反而略有下降。這可能是因為，料液浸提法是一種傳質擴散的過程，當增加溶劑用量時，提取時間也需要延長，因此在限定的時間內提取率會稍有下降[12]。此外液料比過大，不利于濃縮回收，還增加能耗，考慮到節約成本，確定液料比為20∶1。

2.1.3 乙醇體積分數對柚子皮總黃酮提取率的影響 黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇和丙酮等有機溶劑?？紤]溶劑的安全性及有效性，本研究選用乙醇作為浸提劑。乙醇作為浸提劑，具有滲透性強、提取效率高、選擇性好等優點，且黃酮類化合物具有酚羥基在水中有一定的溶解度[13]。由此，確定使用乙醇水溶液作為提取溶劑。由圖3可知，柚子皮中的總黃酮得率隨乙醇體積分數的增加而升高，這可能是由于乙醇體積分數的增加，減少了柚子皮與溶劑間黃酮類化合物的濃度差，從而增加了柚子皮中總黃酮提取效率，而且隨著乙醇體積分數增大，部分脂溶性黃酮一并提取，所以吸光度和黃酮得率在不斷增大[14]。乙醇體積分數達到70%時，提取率最高，而后反而下降。這可能是由于乙醇體積分數過高時，乙醇大量揮發，同時增加了一些醇溶性雜質、色素、親脂性強成分的溶出，與黃酮類化合物競爭與乙醇結合，且乙醇體積分數過高降低了水溶性黃酮的溶解度，從而導致總黃酮提取率的下降[11]。因此，確定乙醇體積分數為70%。

2.1.4 提取時間對柚子皮總黃酮提取率的影響 由圖4可知，柚子皮總黃酮的提取率隨時間的增加而快速增加，2.0 h達到最高；此后隨著時間的延長，總黃酮提取率反而略有下降，究其原因可能是提取時間太長，部分乙醇揮發導致沸點增大，提取液中對熱敏感的黃酮類化合物發生水解[15]，進而影響柚子皮總黃酮提取率。因此，為使浸提充分又節約能耗，初步確定提取時間為2.0 h。

2.2 響應面分析

由單因素試驗結果可以看出，柚子皮總黃酮的提取效果取決于提取溫度、液料比、乙醇體積分數、提取時間的選擇以及各提取條件間的相互組合[16]。采用響應面法優化柚子皮總黃酮的提取條件，在單因素試驗的基礎上，以提取溫度、液料比、乙醇體積分數、提取時間為自變量，總黃酮提取率為響應值，采用Design Expert 8.06軟件根據Box-Behnken設計原則設計試驗，并對所得數據進行分析（表1）。

2.1.1 擬合模型 根據Box-Behnken設計原則，Design Expert 8.06軟件設計了29組試驗（表2），被用于優化提取條件。采用方差分析（ANOVA），二階多項式模型來計算預測的響應，公式如下：

Y=0.82+5.18×10-3A-9.2×10-3B+0.026C-0.027D+2.53×10-3AB-1.75×10-3AC+3.25×10-3AD+5.03×10-3BC-0.011BD-5×10-4CD-0.057A2-0.053B2+0.027C2+7.517×10-3D2。

式中，Y表示總黃酮提取率，A表示提取溫度，B表示液料比，C表示乙醇體積分數，D表示提取時間。其中，R2=0.998 6，表明方程可信度較好，能夠準確地分析和預測黃酮的提取條件。

采用F檢驗、P值來評價模型方程的統計學意義，F值和P值用來檢驗每個系數的顯著性。F越大，P值越小，則相應的系數越顯著。根據方差分析結果（表3），模型的F為698.65，P<0.000 1，這表明模型極顯著。系數A、B、C、D、AD、BC、BD、A2、B2、C2、D2均顯著（P<0.05），其他系數并不顯著（P>0.05）。此外，失擬項F為1.22，P=0.459>0.05，說明了失擬性誤差不顯著。決定系數（R2=0.998 6）的值接近于1，表明預測值與實際值具有有效的關聯性。調整后的決定系數（R2adj=0.997 1）也接近1，這表明試驗值可以由模型來預測。

2.1.2 響應面分析 響應面模型是表達不同參數對總黃酮提取效果的最好方式。三維（3D）響應面作為回歸方程的一個重要組成部分，可以描述兩個變量之間的相互作用，并確定它們的最優水平。它提供了一個有效的方法來反映響應值與各變量試驗水平間的關系及兩個變量間相互作用的類型。圖的形狀可以反應變量之間的相互作用是否顯著[17]。圖5顯示提取溫度、液料比、乙醇體積分數、提取時間之間的相互作用對總黃酮提取率的影響。結合方差分析，可以知道提取溫度-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-A）；乙醇體積分數-提取溫度之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-B）；提取時間-溫度之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-C）；乙醇體積分數-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-D）；提取時間-液料比之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-E）；提取時間-乙醇體積分數之間的相互作用對總黃酮提取率影響顯著（圖5-F）。由此可知，總黃酮提取量與提取時間、 乙醇體積分數呈正比；提取溫度以及液料比會對提取效果帶來較大影響；各因素之間存在明顯的交互作用。同時采用乙醇提取柚子皮總黃酮時，提取溫度不宜過高，提取時間不宜過長。柚子皮總黃酮中的柚皮苷為酚羥基化合物，溫度過高、時間過長時柚皮苷容易氧化，反而導致提取率下降[10]。endprint

回歸分析結果與4個因素對響應值的影響以及各因素之間的交互影響相吻合。在響應面最高點和等高線所選范圍內存在極值，即為最優點。綜上分析，柚子皮總黃酮最佳提取條件為溫度72.39 ℃，液料比為20.40∶1，乙醇體積分數為82.56%，提取時間為1.5 h。根據實際試驗條件，將提取條件調整為溫度70 ℃，液料比為20∶1，乙醇體積分數為80%，提取時間為1.5 h。在此條件下，重復5次，柚子皮總黃酮提取率接近預測值，證明擬合響應面模型的適用性。因此，響應面設計更好地預測了柚子皮總黃酮的提取效果，可信度高。

3 結論

采用 Design-Expert 8.06軟件的Box-Behnken設計原則設計響應面試驗，建立數學模型。方差分析結果表明，柚子皮中總黃酮提取量與提取時間、乙醇體積分數呈正比；同時提取溫度和液料比也對提取效果影響較大。通過響應優化及根據實際試驗條件，柚子皮中總黃酮最佳提取條件為溫度70 ℃、液料比為20∶1、乙醇體積分數為80%、提取時間為1.5 h，在此條件下總黃酮提取率可達到0.864%。

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