miR-429在膀胱癌中的表達及作用機制

吳 斌，房杰群，溫似春

1深圳市光明新區人民醫院泌尿外科，廣東 深圳 518106；2深圳市人民醫院泌尿外科，廣東 深圳 518020；3廣東省人民醫院協和病區，廣東 廣州 510080

膀胱癌為泌尿系統最常見的惡性腫瘤[1]。據統計，2013年美國約有72 500例新診斷的膀胱癌和17 960例膀胱癌死亡病例[2]。膀胱癌有很多病理類型，尿路上皮癌占膀胱癌的90%左右[3]。膀胱癌細胞的復雜表型由功能性反應基因控制。MicroRNA主要是抑制基因表達的小型非編碼RNA，它們在癌癥中增加或減少，能夠促進或抑制癌癥發展[4]。有文獻報道，miR-429在癌癥中表達增加，如子宮內膜癌和結腸直腸癌[5-6]。但有研究表明，miR-429在骨肉瘤，腎細胞癌和宮頸癌中起著抑制腫瘤作用[7-8]。國內研究發現miR-429在膀胱癌中的表達是增加的[9]。miR-429屬于miR-200家族，也有文獻報道miR200家族在膀胱癌中的表達上調，高microRNA-200C表達與膀胱肌肉浸潤性尿路上皮癌中疾病死亡的風險之間應該存在正相關關系[10]。本文為探究miR-429在膀胱癌中的表達及作用機制做了如下研究：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省內3家醫院2014年1月～2016年12月期間收集的膀胱癌標本120例，同時選取距離腫瘤邊緣大于2 cm的癌旁組織作為對照。所有患者已經病理科明確診斷。具體情況見表1。排除標準：嚴重電解質紊亂者；嚴重肝腎功能不全、心功能不全、嚴重感染者；神志不清，無法配合著。所有受試者已獲得知情同意，并已通過我院倫理會的批準。

表1 膀胱癌一般情況分布表（n=120）

1.2 研究方法

1.2.1 組織標本的收集 收集手術過程中經病理確診的膀胱癌組織，和距離腫瘤邊緣大于2 cm（鏡下未見癌細胞）的癌旁組織，大小0.5 cm×0.5 cm，將組織置于裝入凍存管，置于液氮罐中保存。

1.2.2 RNA的提取和miR-429的QRT-PCR測定 采用Trizol（Invitrogen，Life Technologies）法從組織內提取總RNA，然后反轉錄成cDNA（PrimeScript RT Reagent Kit，Takara）。用 QRT-PCR法（SYBR Premix Ex Taq Kit，Takara ，7500 real-time PCR system ，Applied Biosystems）測定血清miR-429的表達，用用U6 miRNA作為內參。

miR-429 擴 增 引 物 ：F ：5 ′-GGAATGCGCGA GGAGAACAA-3 ′，R:5 ′-CATCATCATGACCTG GATCGC-3，U6 miRNA擴增引物：F：5′-ATTGGAA CGATACAGAGAAGATT-3 ′，R: 5 ′-GGAACGCT TCACGAATTTG-3′。使用公式2–ΔΔCt計算miR-21相對表達量。

1.2.3 細胞培養 用含有10%的胎牛血清，1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM培養T24細胞系（膀胱癌細胞系）。根據細胞生長情況每1～3 d更換1次培養基。

1.2.4 RNA干擾實驗 嚴格按照說明書（廣州瑞博siRNA使用說明（2009-08））進行操作。設置miR-429過表達模型（miR-429 mimic），空白對照（miR-429 mimic control）；miR-429敲除模型（siRNA），空白對照（siRNA control）。分別觀察miR-429過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況。

1.2.5 細胞增殖和細胞凋亡實驗 采用MTT比色法判斷細胞增殖情況；采用Caspase 3 ELISA試劑盒（R&D，Minneapolis，MN，USA）判斷細胞凋亡情況。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19. 0 軟件對數據進行分析。計量資料采用均數±標準差表示，計量資料比較用獨立樣本的t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 miR-429的相對表達量

膀胱癌組織miR-429的相對表達水平高于正常膀胱組織，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 miR-429在膀胱癌組織組織和癌旁組織的表達

2.2 miR-429的表達水平與膀胱癌臨床相關參數的關系

由表2可知，miR-429的表達水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無淋巴結轉移，以及TNM分期有關（P＜0.05）；腫瘤直徑大于5 cm組miR-429的表達水平高于腫瘤直徑小于5 cm組；有淋巴結轉移的膀胱癌組miR-429的表達水平高于無淋巴結轉移的膀胱癌組；Ⅲ+Ⅳ期膀胱癌組miR-429的表達水平高于Ⅰ+Ⅱ期膀胱癌，差異具有統計學意義（P＜0.05）。miR-429的表達水平與膀胱癌患者的年齡、性別無關（P＞0.05）。

2.3 miR-429過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況

miR-429過表達時，膀胱癌細胞（T24細胞系）增殖增加，凋亡減少；而miR-429敲除時，膀胱癌細胞（T24細胞系）增殖減少，凋亡增加（圖2）。

表2 miR-429的表達水平與膀胱癌臨床相關參數的關系

3 討論

統計顯示全球有270萬人患有膀胱癌[11]。 在發展中國家，人口老齡化和煙草使用量高使得膀胱癌的發病率顯著高于發達國家[12]。大約25%的新診斷的膀胱癌患者存在肌肉侵襲，需要根治性手術或放射治療[13]。腫瘤的發生是一個復雜生物學過程，涉及到多種細胞因子、蛋白、生長分化因子的參與。近年來，關于miRNA與腫瘤發生發展的關系逐漸成為研究熱點，研究發現，miRNA與多種腫瘤的發生發展相關[14]。miRNAs參與人類30%～60%基因的轉錄后調節[15]。由于1個miRNA可作用于上百個不同的基因，因此miRNA的功能失調，可導致正常細胞向癌細胞轉化。國外文獻報道，超過一半的miRNAs基因位于腫瘤相關基因組區或脆性位點[16]。提示miRNAs在人類腫瘤的發生發展中起重要作用。

圖2 miR-429過表達或者敲除時T24細胞增殖和凋亡情況

本研究發現，膀胱癌組織miR-429的相對表達水平高于正常膀胱組織（P＜0.05），這與Yang等[17]研究結果相一致，提示miR-429可能在膀胱癌的發生發展中起著重要作用。進一步相關分析顯示，miR-429的表達水平與膀胱癌的腫瘤大小、有無淋巴結轉移、TNM分期有關（P＜0.05）。有研究對165例神經膠質細胞患者進行追蹤隨訪，也發現miR-429高表達的患者，其腫瘤較早發生轉移[18]，這也與本研究結果相類似。但也有研究認為miR-429可以抑制星細胞瘤的增殖，可能miR-429在不同類型的腫瘤中具有不同的作用機制[19]。實驗結果也發現miR-429可以促進膀胱癌細胞增殖，抑制凋亡。miR-429在膀胱癌中的可能作用機制：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（CDKN2B）是一種腫瘤抑制因子，CDKN2B 3′UTR具有miR-429的結合位點，miR-429可以與CDKN2B結合[20]。miR-429表達增加，可以抑制CDKN2B的表達，從而促進促進膀胱癌細胞增殖，抑制凋亡。miR-429還可以調控PTEN、RASSF8和TIMP2等抑癌基因以促進腫瘤發生[21]。

綜上所述，miR-429在膀胱癌的發生發展中起著重要作用，其表達水平對膀胱癌的嚴重程度及預后情況具有一定的參考價值。

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