玉屏風顆粒對急性發作期哮喘患兒H4R表達的影響

高宇，沈朝斌，周霖，劉曉穎，雷蕾，曹詩燕，蔣瑾瑾

（1.第二軍醫大學附屬長海醫院兒科，上海 200433；2.上海中醫藥大學附屬上海市中西醫結合醫院兒科，上海 200082）

支氣管哮喘是兒童常見的一種呼吸道疾病，由肥大細胞、T淋巴細胞、嗜酸性粒細胞以及上皮細胞、中性粒細胞等氣道炎性細胞以及結構細胞和細胞組分參與，以氣道高反應性和慢性氣道炎癥為主要特征，其反復發作，遷延難愈，對家庭和社會造成了不可忽視的影響［1］。全球范圍內，隨著氣候環境的惡化，哮喘的發病率和死亡率呈現出逐年上升的趨勢［2］。玉屏風顆粒具有抗炎、抗菌、抗過敏及調節免疫功能的作用，對哮喘有一定的治療效果。為此，我科對玉屏風顆粒治療哮喘展開相關研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月—12月在第二軍醫大學附屬長海醫院兒科就診的哮喘患兒120例分別納入哮喘急性發作期組及哮喘臨床緩解期組。其中哮喘急性發作期組患兒表現為突然發生喘息、咳嗽、氣促、胸悶等癥狀，共選取60例，其中男性36例，女性24例，年齡3.42～12.58歲，平均（7.15±2.14）歲；哮喘臨床緩解期組患兒指經過治療或未經治療哮喘癥狀、體征消失，肺功能恢復到急性發作前水平，并維持3個月以上，共選取60例，其中男性34例，女性26例，年齡3.83～12.42歲，平均（7.16±2.02）歲；同時選取同期來我科門診體檢的健康兒童60例為健康對照組，其中男性35例，女性25例，年齡3.75～11.75歲，平均（6.93±1.89）歲。以上三組性別、年齡組成均差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究得到了第二軍醫大學附屬長海醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 入選標準 診斷符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）［3］哮喘診斷標準：（1）反復喘息、咳嗽、氣促、胸悶，多與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激、呼吸道感染、運動以及過度通氣（如大笑和哭鬧）等有關，常在夜間和（或）凌晨發作或加劇；（2）發作時雙肺可聞及散在或彌漫性，以呼氣相為主的哮鳴音，呼氣相延長；（3）上述癥狀和體征經抗哮喘治療有效，或自行緩解；（4）除外其他疾病所引起的喘息、咳嗽、氣促和胸悶；（5）患兒近親屬均簽署知情同意書。

1.3 排除標準 有以下情況者需排除：（1）近8周內使過抗組胺藥物或者糖皮質激素；（2）患兒已使用或曾使用其它中成藥或中藥湯劑；（3）用過免疫抑制劑或患有其他免疫系統疾病者；（4）急性發作期重癥哮喘，并需靜脈補液治療。

1.4 治療方法及療程 將60例支氣管哮喘急性發作期患兒確診后均按哮喘急性發作期醫院治療流程，吸入速效β2受體激動劑聯合抗膽堿能藥物、吸入糖皮質激素（ICS）及氧療，存在感染者予抗感染治療，待將哮喘控制進入不需要使用糖皮質激素的治療階段后，將患兒采用隨機數字表法隨機分為兩組，其中常規治療組30例，玉屏風組30例，兩組患兒在性別、年齡、病程及病情輕重方面差異無統計學意義。常規治療組給孟魯斯特（順爾寧，默沙東投資有限公司），1～5歲4 mg，每晚頓服；＞5歲5 mg，每晚頓服，連續用藥8周；玉屏風組除給予孟魯斯特治療外，聯合玉屏風顆粒（廣東環球制藥有限公司）口服治療，3～6歲每次5 g，每日2次；＞6歲每次5 g，每日3次，持續治療8周。

1.5 實驗室指標檢測 用實時定量熒光聚合酶鏈反應（RT-PCR）及 Western蛋白印跡法（Western blot）檢測支氣管哮喘急性發作期患兒、支氣管哮喘臨床緩解期患兒、健康對照兒童三組對象外周血單個核細胞中組胺H4R的基因含量及蛋白表達，用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測三組對象外周血血清人白細胞介素-12（P70）［IL-12（P70）］的含量。

用RT-PCR及Western blot檢測玉屏風組和常規治療組治療前后外周血單個核細胞中組胺H4R的基因含量及蛋白表達，用ELISA法檢測兩組對象治療前后血清IL-12（P70）水平的變化。

1.6 主要儀器與試劑 PCR儀ViiA7（life technology ABI），電泳儀、轉膜儀DYCZ-40D（北京市六一儀器廠），X射線攝影暗匣AX-II（廣東粵華醫療器械廠有限公司），酶標儀DNM-9602（北京普朗新科技有限公司），H4R、β-actin引物（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（Biotnt），BCA蛋白定量試劑盒（Roche），IL-12（P70）ELISA試劑盒（博士德生物）。

1.7 研究方法 入組兒童均于清晨空腹采集靜脈血3 mL×2管，4℃下離心20 min，轉速3 000 r·min－1，取血清置于超低溫冰箱（－80℃）中采用ELISA法待檢IL-12（P70）水平，具體操作程序嚴格按說明書進行；留取下層血樣，用密度梯度離心法分離并提取外周血單個核細胞，最后放置－80℃的冰箱中保存，用RT-PCR及Western blot檢測組胺H4R的基因含量及蛋白。

1.7.1 使用RT-PCR進行H4R mRNA的檢測 在Genbank查找H4R及內參基因的mRNA序列，采用oligo和primer5設計引物，設計好的引物由Invitrogen公司合成。H4R的引物：上游引物5′-GTC CCA TTT CTT CCT GTT-3′，下游引物 5′-GCA GTC TCT TCA CCA TCT-3′；內參基因β-actin引物：上游引物5′-GAA ATC GTG CGT GAC ATT-3′，下游引物 5′-AGG CAG CTC GTA GCT CTT-3′。

采用Trizol一步法從細胞中提取總RNA，異丙醇法濃縮RNA，提取出的mRNA進行逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR合成，用逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA后，再用定量PCR儀進行定量PCR檢測。

1.7.2 使用Western blot檢測H4R的蛋白表達將樣本進行總蛋白的提取，使用BCA系統進行蛋白初定量，根據標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度，利用BCA蛋白定量結果，均一化所有樣本總蛋白濃度，將樣本放入恒溫金屬浴95℃15 min，取出即可上樣電泳，電泳轉膜后，將轉膜制得的承載膜先置于TBST中浸潤，在麗春紅中染色，驗證轉膜成功后用TBST將麗春紅洗脫，進入孵育步驟，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入稀釋過的GPADH一抗 （1∶500），4℃孵育過夜或者室溫孵育1.5 h，0.1%TBST液洗膜10 min×3次，加入對應稀釋過的二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h洗膜10 min×3次，洗膜后加入ECL發光液，曝光，顯影，定影，此時X線片上相應位置的黑色條帶即為最終結果。

1.8 統計學方法 采用統計軟件（SPSS19.0）對數據進行分析。計量資料，正態分布者以x±s表示。三組間結果比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間均數的比較采用獨立樣本t檢驗，同一組別治療前后比較采用配對樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組對象組胺H4R mRNA的表達水平及IL-12（P70）的水平 哮喘急性發作期組患兒H4R mRNA表達明顯高于哮喘臨床緩解期組患兒、健康對照組兒童（P＜0.05），哮喘急性發作期組患兒IL-12（P70）低于哮喘臨床緩解期組患兒、健康對照組兒童，其差異有統計學意義（P＜0.05）；哮喘臨床緩解期組患兒H4R mRNA及IL-12（P70）與健康對照組兒童差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 哮喘急性發作期、臨床緩解期、健康對照組H4R mRNA及 IL-12（P70）的表達

2.2 三組對象組胺H4R的蛋白表達 見圖1。哮喘急性發作期組患兒H4R的蛋白表達均高于哮喘臨床緩解期組患兒及健康對照組兒童，哮喘臨床緩解期組患兒H4R蛋白表達與健康對照組兒童無明顯差異。H4R的蛋白表達結果與H4R mRNA表達結果一致。

圖1 哮喘急性發作期、臨床緩解期、健康對照組H4R的蛋白表達

2.3 玉屏風組和常規治療組治療前后組胺H4R mRNA的表達水平及IL-12（P70）的水平 玉屏風組治療前H4R的mRNA、IL-12（P70）水平與常規治療組治療前水平差異無統計學意義（P＞0.05），具有可參照意義；玉屏風組治療前后H4R的mRNA及IL-12（P70）水平變化差異有統計學意義（P＜0.05）；常規治療組治療前后 H4R的mRNA、IL-12（P70）水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）；玉屏風組治療后H4R的mRNA、IL-12（P70）水平與常規治療組治療后的水平變化差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.4 玉屏風組和常規治療組治療前后組胺H4R的蛋白表達變化 見圖2。哮喘患兒玉屏風組治療前后H4R的蛋白表達變化有差異，常規治療組治療前后H4R的蛋白表達無明顯差異。H4R的蛋白表達變化與H4R mRNA表達變化一致。

表2 玉屏風組和常規治療組治療前后H4RmRNA及IL-12（P70）的表達變化

圖2 玉屏風組和常規治療組治療前后H4R的蛋白表達

3 討論

支氣管哮喘是一種兒童常見的氣道慢性炎癥性疾病，其發病率正在逐年上升。吸入性糖皮質激素布地奈德可抑制多種細胞因子的活性而達到控制哮喘患者的呼吸道炎癥反應和抑制重塑［4］。但臨床研究發現，單純應用激素雖能較快緩解癥狀，但對于減少急性哮喘發作次數效果不大，不能改善免疫功能，長期使用可產生一定的副作用［5］。白三烯也參與哮喘發病的多項環節，在哮喘炎癥中發揮重要作用。白三烯受體拮抗劑可降低人半胱氨酰白三烯誘導的黏附分子Mac-1的表達和嗜酸性粒細胞游走遷移，抑制氣道嗜酸性粒細胞增殖和活化，減少氣道嗜酸性粒細胞的浸潤，抑制氣道變態反應性炎癥及對多種炎性介質和細胞因子產生抑制作用［6］。但在臨床應用中，單純使用白三烯受體拮抗劑孟魯司特控制哮喘發作效果不令人滿意。因此，調節哮喘患兒免疫功能至關重要，是預防哮喘發作、達到長期緩解和治愈的重要環節。

玉屏風顆粒主要成分為黃芪、白術、防風，三藥合用，猶如在人體表面形成一道屏障，使邪自祛，表自固，氣通暢［7］。現代藥理學研究表明玉屏風顆粒可雙向調節人體免疫狀態。有研究表明［8］，玉屏風顆粒能下調血清IL-4水平、提升IFN-γ的表達水平，誘發Th1細胞應答，抑制Th2細胞應答，調節支氣管哮喘患者的Th1／Th2免疫失衡，從而改善支氣管哮喘的治療功效。最近又有相關研究表明玉屏風可通過對miR-210和miR-126表達的影響抑制參與哮喘的發病機制的Th2和Th17細胞，通過調節Th細胞而達到治療哮喘的功效［9］。

組胺在過敏反應中起著重要的作用［10］。組胺的生物效應是由組胺受體介導的，H4R是近來比較新發現的受體，具有獨特的藥理學性質，參與了肥大細胞、樹突狀細胞和嗜酸性粒細胞的趨化過程以及T細胞、樹突狀細胞細胞因子的產生。因為這些細胞都涉及哮喘的病因學，并且由于H4R在所有這些細胞中都有表達，因此提示H4R可能在哮喘發病中發揮了重要的作用。

2006年，Dunford等［11］發現 H4R缺陷型小鼠和使用H4R拮抗劑的小鼠患過敏性肺炎的概率較普通小鼠減少。在H4R缺陷型小鼠中，觀察到浸潤性肺嗜酸性粒細胞數目和淋巴細胞的數目均減少，Th2應答也減輕。Cowden等［12］通過小鼠模型研究發現，使用 H4R拮抗劑 JNJ7777120和JNJ28307474可通過減少IL-4、IL-6等Ⅱ類細胞因子及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子等炎性因子的表達水平，可從而減少嗜酸性粒細胞的浸潤及樹突狀細胞的趨化作用。這些都說明H4R可以調節Th1／Th2的平衡。

研究發現［13］，H4R可通過抑制核因子-κB通路下調脂多糖誘導的細胞因子IL-27，而IL-27為細胞因子IL-12家族中一員，從而使Th1細胞型更多向Th2細胞型轉化。H4R的刺激可活化轉錄因子AP-1并抑制IL-12P70水平［14］。也有研究證明H4R激活樹突狀細胞產生的TNF-α和IL-12水平較低。由于IL-12是調節Th1細胞分化的主要細胞因子之一，可誘導T細胞向Th1細胞分化，并促進Th1分泌IFN-γ、TNF-α及IL-2等細胞因子，同時 IL-12能抑制Th2類細胞因子如IL-4、1L-5等的產生，從而抑制Th2型免疫應答和氣道炎癥反應。故IL-12水平的變化與Th1／Th2細胞亞群失衡密切相關。

本實驗發現支氣管哮喘急性發作期患兒組胺H4R表達增高，IL-12（P70）表達降低，而處于臨床緩解期患兒與正常兒童水平無差異，說明組胺H4R、血清IL-12（P70）參與了支氣管哮喘急性期的炎癥反應。發現僅用孟魯司特對于哮喘患兒組胺H4R及IL-12（P70）表達無明顯影響，加用玉屏風顆粒能明顯抑制組胺H4R的mRNA及蛋白的表達，提升IL-12（P70）水平，說明玉屏風顆粒能抑制組胺H4R的表達，有效促進IL-12的分泌，促進Th1細胞分化，抑制Th2合成，從而調節與哮喘發生相關的細胞因子的表達，起到免疫調控作用。

［1］ 程詩亮，江春燕，倪美良.miR-21與IL-12在兒童支氣管哮喘血清中的含量及意義［J］.浙江臨床醫學，2016，18（2）：347-348.

［2］ 王文東，張念志.氣管哮喘緩解期的中醫治療進展［J］.河南中醫，2013，2（6）：21-23.

［3］ 中華醫學會兒科學分會呼吸學組.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）［J］.中華兒科雜志，2016，16（3）：167-181.

［4］ 賴天文，呂瑩瑩，王少冰，等.Notch配體在哮喘氣道重塑小鼠中的表達及布地奈德的干預作用［J］.分子影像學雜志，2016，16（4）：397-402.

［5］ 張玉泉.玉屏風顆粒對兒童哮喘緩解期的免疫調節作用［J］.承德醫學院學報，2013，30（4）：299-301.

［6］ 徐佳莉.孟魯司特治療咳嗽變異性哮喘80例［J］.中國醫院藥學雜志，2012，32（14）：1137-1139.

［7］ 黃秀君.玉屏風散輔助治療小兒咳嗽變異性哮喘臨床觀察［J］.新中醫，2015，47（10）：141-143.

［8］ 蔡旭俊.玉屏風顆粒對支氣管哮喘患兒Th1／Th2免疫平衡的影響［J］.中國實用醫刊，2014，41（5）：9-11.

［9］ 丁肖媛，蔡紅，王嵩，等.玉屏風散對支氣管哮喘小鼠微小RNA表達的影響［J］.中華實用兒科臨床雜志，2016，31（4）：284-287.

［10］CHEN O，ZHU XB，REN H，et al.The imbalance of Th17／Treg in Chinese children with Henoch-Schonlein purpura［J］.Int Immunopharmacol，2013，16（1）：67-71.

［11］DUNFORD PJ，O′DONNELL N，RILEY JP，et al.The histamine H4 receptor mediates allergic airway inflammation by regulating the activation of CD4＋T cells［J］.J Immunol 2006，176（11）：7062-7070.

［12］COWDEN JM，ZHANG M，DUNFORD PJ，et al.The histamine H4 receptor mediates inflammation and pruritus in Th2-dependent dermal inflammation［J］.J Invest Dermatol，2010，130（4）：1023-1033.

［13］GUTZMER R，KOETHER B，GSCHWANDTNER M，et al.Histamine downregulates IL-27，another member of the IL-12 family，via H2R and H4R on human monocytes［C］.The European Histamine Research Society Meeting，Durham，UK，2010.

［14］GSCHWANDTNER M，SCH?KEL K，WERFEL T，et al.Histamine H4 receptor activation on human slan-dendritic cells down-regulates their pro-inflammatory capacity［J］.Immunology，2011，132：49-56.