白藜蘆醇通過調節Ca2+濃度對小鼠外周疼痛的影響及作用機制

王林，潘建春

（1.杭州市第一人民醫院 藥學部，浙江 杭州 310006；2．溫州醫科大學 腦科學研究所，浙江 溫州325035）

圖1 小鼠甩尾實驗中白藜蘆醇和MK801對甩尾潛伏期的作用

鈣離子（Ca2+）作為第二信使，參與細胞內一系列功能活動，包括電生理活性、神經遞質釋放、蛋白磷酸化和基因表達等[1]。有研究表明中樞Ca2+與疼痛的傳遞密切相關，例如通過熱板實驗和甩尾實驗，灌胃給予L-型鈣通道拮抗劑尼莫地平、硝苯地平等提高對疼痛作用的閾值[2-3]。急性或者慢性鞘內注射N-型Ca2+通道拮抗劑ω-conopeptides在熱板實驗同樣產生疼痛作用。更進一步，有研究表明Ca2+/咖啡因敏感微粒體池、鈣調蛋白、CaMKIIK參與嗎啡和β-內啡肽的鎮痛作用[4-6]。增加細胞內Ca2+濃度可以拮抗阿片類（包括嗎啡、β-內啡肽和腦啡肽）產生的鎮痛作用。注射Ca2+和Ca2+載體（如X-537A和A23187），可以把Ca2+從細胞外轉移到細胞內，從而增加細胞內Ca2+濃度，減弱阿片類產生的鎮痛作用[7]。相反腦內注射Ca2+螯合劑EGTA可以加強阿片類產生的鎮痛作用。Ca2+極容易從N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體通道滲透進入細胞內[8]。有研究者發現在機械超敏實驗和熱痛覺超敏實驗中白藜蘆醇可以劑量依賴性翻轉神經壓迫疼痛[9-13]。本研究旨在探討Ca2+是否參與白藜蘆醇的鎮痛作用。

1 材料和方法

1.1 藥物、主要試劑及儀器 白藜蘆醇購自武漢圣天宇公司，尼莫地平購自美國ENZO公司，CaCl2購自衢州巨化試劑公司，EGTA購自中國醫藥集團總公司，蘭尼定購自英國Tocris生物科學公司，Mk801購自美國Sigma公司，小鼠固定器、腦立體定位儀和微量進樣器購自深圳瑞沃德公司。

1.2 動物分組和模型制備 雄性ICR小鼠，體質量25～30 g，由中國科學院上海動物中心提供。動物許可證號：SCXK（滬）2013-0017。飼養條件：8只/籠，室溫（24±1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，晝夜節律，自由攝食飲水。所有動物適應環境5 d后開始實驗，實驗前禁食10 h，飲水自由。小鼠分組為白藜蘆醇（10、20、40 mg/kg，p.o.）組，白藜蘆醇（10 mg/kg，p.o.）聯合使用MK801（0.5 mg/kg，i.p.）組、白藜蘆醇（10 mg/kg，p.o.）聯合使用尼莫地平（2.5、5、10 mg/kg，i.p.）組、白藜蘆醇（20 mg/kg，p.o.）聯合使用CaCl2（25、50、100、200 nmol/只，i.c.v.）組、白藜蘆醇（10 mg/kg，p.o.）聯合使用蘭尼定（0.25、0.5、1、2 nmol/只，i.c.v.）組和白藜蘆醇（10 mg/kg，p.o.）聯合使用EGTA（5、15、30 nmol/只，i.c.v.）組，以上各劑量組每組8只小鼠。

白藜蘆醇（10、20、40 mg/kg）溶解于0.5%羧甲基纖維素鈉中，其他試劑溶解于0.9%氯化鈉溶液，尼莫地平另外滴加一滴乙醇，使充分溶解。白藜蘆醇給藥30 min后，進行甩尾實驗；聯合用藥組分別給予MK801或尼莫地平或CaCl2或蘭尼定或EGTA后5 min，再給予白藜蘆醇30 min后，進行甩尾實驗。空白組1給予0.9%氯化鈉溶液或0.5%羧甲基纖維素鈉，空白組2單獨給予白藜蘆醇。

腦內注射給藥參考文獻[14]的方法，小鼠海馬CA1區注射1 μL液體。小鼠麻醉后，固定好頭部，27G針連接到50 μL微量進樣器，進樣器注射進針深度2 mm，注射1 μL液體。注射點位置在中縫線兩側2 mm，前囟點后面2 mm，注射到海馬CA1區。為了驗證注射點的位置，向注射位置注入10 μL 1%甲基藍染料，進行組織學研究。

1.3 甩尾實驗檢測痛覺潛伏期 通過測試小鼠甩尾的潛伏期評價藥物產生鎮痛作用的效果，主要評價外周疼痛。將小鼠尾巴浸入水面以下3 cm，水溫是（52.0±0.5）℃，小鼠受到熱刺激，記錄尾巴甩出水面的時間作為疼痛的閾值，為了避免產生組織損傷，截止時間為10 s。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。計量資料以 ±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett’s t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MK801對白藜蘆醇鎮痛作用的影響 在甩尾實驗中，與空白組1比，白藜蘆醇（10、20、40 mg/kg，p.o.）使小鼠甩尾的潛伏期顯著延長（P＜0.01）。在白藜蘆醇的不同劑量中，小鼠的甩尾潛伏期呈劑量依賴關系。預先使用MK801阻斷NMDA受體通道以后，白藜蘆醇的鎮痛作用明顯增加強（P＜0.01）。見圖1。

2.2 尼莫地平對白藜蘆醇鎮痛作用的影響 白藜蘆醇閾下劑量10 mg/kg在甩尾實驗中不產生鎮痛作用，但是在聯合使用尼莫地平以后，白藜蘆醇的鎮痛作用得到明顯加強（P＜0.05）。見圖2。

2.3 Ca2+和EGTA對白藜蘆醇鎮痛作用的影響 EGTA單獨使用對鎮痛作用沒有影響[1]，但是腦內注射EGTA以后，明顯加強了白藜蘆醇白藜蘆醇（10 mg/kg）的鎮痛作用（P＜0.05）。見圖3。

2.4 蘭尼定對白藜蘆醇鎮痛作用的影響 體外研究表明，蘭尼定抑制Ca2+從細胞內鈣庫的釋放[15-16]。蘭尼定（0.25，0.5，1，2 nmol/只，i.c.v.）單獨使用不產生鎮痛作用或者毒性作用[6]，但是蘭尼定聯合使用閾下劑量白藜蘆醇（10 mg/kg，p.o.）后，明顯增強了白藜蘆醇的鎮痛作用（P＜0.01）。見圖4。

3 討論

急性給予白藜蘆醇以后，對小鼠進行甩尾實驗，產生了明顯的鎮痛作用，表現為小鼠的痛閾值明顯升高（P＜0.01），這表明白藜蘆醇具有鎮痛作用。然后我們設計了一系列與Ca2+有關的實驗，探討白藜蘆醇的鎮痛作用是否與Ca2+有關。

Ca2+從細胞外轉移到細胞內，可以通過NMDA受體進入細胞，它是高度通透Ca2+的[16-17]。NMDA受體通道有配體和電壓門控兩種獨特的的門控方式，在靜息電位時電壓門控由Mg2+阻斷離子通道，當膜去極化以后，Mg2+離去，NMDA受體通道開放，Ca2+進入細胞內。當預先給予NMDA受體拮抗劑MK801，谷氨酸無法與其受體結合，因此Mg2+無法從膜上離去，從而導致Ca2+通道處于關閉狀態，細胞外Ca2+無法從這一通道進入細胞內，細胞內Ca2+減少，濃度降低，增強了白藜蘆醇的鎮痛作用。

給予L-型鈣通道拮抗劑尼莫地平（2.5～10 mg/kg，i.p.）對小鼠不產生鎮痛作用[1]，但是尼莫地平顯著增強了白藜蘆醇閾下劑量（10 mg/kg）的鎮痛作用。L-型鈣通道拮抗劑增強白藜蘆醇鎮痛作用的具體機制仍然不清楚。尼莫地平拮抗L-型鈣通道后使細胞內Ca2+濃度降低，增強了白藜蘆醇的鎮痛作用。

腦內注射Ca2+減弱了白藜蘆醇的鎮痛作用，而注射Ca2+選擇性螯合劑EGTA卻增強了白藜蘆醇的鎮痛作用。神經元內Ca2+濃度降低會產生鎮痛作用，而細胞內Ca2+濃度升高則拮抗鎮痛作用[18-19]，進而我們提出白藜蘆醇的鎮痛作用與細胞內Ca2+濃度降低或升高有關的假設。與腦內注射Ca2+螯合劑EGTA相反，注射Ca2+直接使突觸內Ca2+濃度升高，并且使神經元發揮功能[21]。在海馬CA1區注射Ca2+升高細胞外Ca2+濃度，然后增加Ca2+透膜進入細胞，從而升高細胞內Ca2+濃度，阻斷了白藜蘆醇產生的鎮痛作用。與L-型鈣通道拮抗劑類似，腦內注射Ca2+選擇性螯合劑EGTA，細胞外Ca2+濃度降低，能夠進入細胞內的Ca2+減少，進而降低細胞內Ca2+的濃度，從而增強了白藜蘆醇的鎮痛作用。

圖3 小鼠甩尾實驗中CaCl2和EGTA對甩尾潛伏期的影響

圖2 小鼠甩尾實驗中尼莫地平對甩尾潛伏期的影響

圖4 小鼠甩尾實驗中蘭尼定對甩尾潛伏期的影響

與大多數細胞相似，在神經元內Ca2+濃度不僅受從細胞外透膜進入細胞內的Ca2+調節，還受細胞內通過三磷酸肌醇和蘭尼定受體影響鈣庫的Ca2+調節[18]。蘭尼定受體在調節微粒體鈣庫Ca2+釋放方面發揮重要作用[19]。SAEKI等[20]發現腦內蘭尼定受體在倉鼠內表達始終是Ca2+和咖啡因敏感的。因此，本研究旨在探討Ca2+從鈣/咖啡因敏感池釋放是否參與白藜蘆醇的鎮痛作用。在本研究中，腦內注射蘭尼定顯著增強了白藜蘆醇的鎮痛作用（P＜0.01）。已經有研究表明蘭尼定阻斷Ca2+從鈣/咖啡因敏感微粒體池釋放[21-23]，注射蘭尼定使細胞內鈣庫中Ca2+的釋放減少，細胞內Ca2+減少，Ca2+濃度降低，增強白藜蘆醇的鎮痛作用。另外蘭尼定降低Ca2+從細胞外進入細胞的速率[23]。因此，蘭尼定通過降低細胞內Ca2+濃度增強白藜蘆醇的鎮痛作用，而腦內注射Ca2+減弱了白藜蘆醇的鎮痛作用。

綜上所述，白藜蘆醇的鎮痛作用可能是通過降低細胞內Ca2+濃度產生的，其具體的作用機制有待于進一步研究。