分子生物傳感器與細胞內分子影像

王殿冰 崔宗強 張先恩

活細胞及活體內生理和病理過程中關鍵分子事件的實時、可視化探測對理解基本生物學過程、闡釋疾病發生機制等具有重要意義。臨床上，疾病的診斷及精準治療也越發依賴影像學手段。分子生物傳感器是一種通過產生可視、可定量信號來指示生物物質或生物事件發生及存在的生物分子系統，在活細胞或者活體內能夠實時動態示蹤生物分子之間的相互作用、生物大分子的定位和運動、生理環境的變化以及一些重要生化反應等。近20年的研究充分表明分子生物傳感器是分子事件“眼見為實”的強有力工具。本文將聚焦其中研究熱度較高的分子信標（molecular beacons，MB）、共振能量轉移系統（包括熒光共振能量轉移和生物發光共振能量轉移）和分子熒光互補系統（如雙分子熒光互補、三分子熒光互補等），重點闡述這幾種分子生物傳感器的原理、特點、活細胞中的應用，探討可能面臨的挑戰及未來發展方向等。

1 分子信標

1.1 分子信標原理

分子信標是由Tyagi和Kramer于1996年根據熒光共振能量轉移原理首次設計的一種具有莖環結構的寡核苷酸熒光探針，亦稱發夾探針。經典的分子信標通常為25～35個核苷酸，包括環形區（Loop）、莖干區（stem）及其所連接的熒光分子和淬滅分子。其中，環形區由15～25個核苷酸組成，可特異性結合靶分子序列。莖干區是5～7個互補堿基對，可在分子信標與靶分子結合過程中發生可逆性解離，用于維持分子特殊形狀。熒光基團和熒光淬滅基團則分別位于莖干區的兩個末端。當無目標序列存在時，分子信標呈現自由狀態，莖干區互補堿基發生結合，促使分子信標形成發夾結構。此時，熒光分子和淬滅分子距離最為接近（約6～10 nm），促發熒光共振能量轉移，即：熒光分子發出的熒光被淬滅分子吸收，并以熱的形式散發，熒光幾乎完全淬滅。相反，當存在目標序列時，分子信標的環形區與靶分子發生雜交，莖干中的互補區打開，由于熒光分子遠離淬滅分子，分子信標的熒光近乎100%恢復，其熒光強度與溶液中靶分子濃度呈正相關。

1.2 分子信標應用

分子信標具有高靈敏度、高特異性、無須除去冗余等優點。檢測聚合酶鏈式反應（PCR）過程中的擴增產物是分子信標問世的初衷。如今，早非局限于此。研究者通過改造經典的分子信標結構、發展多種熒光分子和淬滅分子、偶聯納米材料（如金納米粒子/石墨烯、碳納米管等）等，已成功構建出各種具有優越性能的新型分子信標探針，并將其廣泛應用于基因診斷、核酸檢測、分子示蹤等多個領域。本文主要聚焦分子信標在活細胞內分子影像中的應用。

（1）分子信標在活細胞內示蹤mRNA的研究最為豐富。1998年，Sokol等首次實時示蹤了RNA-DNA雜交，在熒光顯微鏡下檢測到原癌基因vav的10個mRNA分子，即0.1 ag（1 ag＝1×10-18g）的分子信標所產生的雜交信號。隨后，Bratu等開辟了利用分子信標在活細胞中研究mRNA定位、轉運的先河。該團隊在黑腹果蠅卵母細胞中觀察了天然mRNA的運動，并發現mRNA 3′端非翻譯區的遺傳操作或細胞內微管蛋白網絡的化學擾動可以明顯改變mRNA的分布。Vargas等則通過分子信標追蹤活細胞中mRNA分子，進一步對mRNA-蛋白復合物從轉錄位點到核孔的轉運行為進行了可視化研究，提示其轉運過程依賴于酶促反應。筆者團隊利用分子信標技術率先建立了一種在活的寄主細胞內病毒核酸可視化的方法，在熒光顯微鏡下可直觀地看到脊髓灰質炎病毒的正鏈RNA和甲型流感病毒mRNA的動態行為，同時結合其他實驗手段，探討了病毒核酸轉運機制。

（2）分子信標還較為普遍地用于細胞內蛋白質、ATP等分子的檢測與示蹤。這主要通過分子信標與適配子形成的適配子信標（aptamer beacon）來完成。Yamamoto等首次證明了將目標物的適配子結合位點插入分子信標中的可能性，構建了靶向HIV病毒Tat蛋白的高親和力適配子信標。與傳統的分子信標相比，這些信標與目標物序列的匹配數目減少了一半（8個堿基）。筆者團隊利用相同策略，構建了特異識別HIV逆轉錄酶的適配體分子信標，進而實現了活細胞中HIV逆轉錄酶的可視化。Zhang等構建了ATP的分子信標檢測系統，實現了在白血病細胞K562和乳腺癌細胞4T1中ATP的檢測，體外檢測下線低至（1.1～3.2）×10-7mol/L。Tan等和Liu等分別將氧化石墨烯作為ATP分子信標的淬滅分子，獲得了更加穩定、特異的適配子信標，前者可以半定量檢測活細胞內ATP，后者可響應5 mmol/L Ca2+誘導的ATP升高。

目前，針對性發展多功能分子信標，在單細胞、單分子水平示蹤關鍵分子事件的研究工作已經萌芽。例如，Li等設計了一種雙功能分子信標，能夠同時檢測并抑制斑馬魚中的microRNA。Chen等利用分子信標最小工程化地點亮單分子RNA，通過成像技術深入研究了單細胞非編碼RNA（lncRNA）的動力學和定位。這些方向可能成為分子信標在細胞成像領域應用中的主流。

2 共振能量轉移系統

共振能量轉移系統是利用能量轉移原理和基因操縱技術構建的分子傳感體系，主要包括熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）和生物發光共振能量轉移（bioluminescent resonance energy transfer，BRET）。

2.1 熒光共振能量轉移

2.1.1 原理

FRET是1948年由F?rster提出的一種基于能量轉移來測量分子間距離的技術。其基本原理是當供體的熒光發射光譜與受體的吸收光譜重疊，并且供體和受體的距離合適時（一般小于10 nm），就會發生一種非放射性的能量轉移。當以適當頻率的激發光照射供體時，供體會產生振蕩偶極子并與相鄰受體的偶極子產生共振。供體熒光團的能量由于偶極子之間的相互作用非放射性地轉移到受體熒光團。總體而言，產生FRET現象需要同時具備兩個條件：（1）供體分子具有較高的量子產率，其發射光光譜與受體分子的激發光光譜有效重疊；（2）供體和受體分子都處于被激發狀態，兩者之間距離在1～10 nm之間。

2.1.2 特點

在生物學研究領域，FRET技術是研究生物大分子間相互作用，特別是在活細胞生理條件下研究蛋白質-蛋白質間相互作用的有力工具。FRET供、受體主要是熒光蛋白、有機熒光分子、無機納米熒光材料等，其發生需要外界光源激發熒光供體。青色熒光蛋白（CFP）和黃色熒光蛋白（YFP）是最常用的一對供受體。由于FRET嚴格依賴空間距離（1～10 nm），且大多數生物分子介于該尺寸之間，因此，FRET是一把丈量分子空間距離的光學“分子尺”，可以解決生物學中諸多難題，如蛋白質動力學、蛋白質構象變化等。有別于經典的分子發射光譜分析法，FRET最大優點是，該技術利用信號比值而非信號強度進行數據分析，消除了取樣誤差而造成的信號間差異。近年來，由于新型熒光材料的出現、光學技術的進步以及顯微成像工具的發展，FRET技術在空間分辨率、檢測靈敏度等方面有了極大的提升，目前已實現單分子FRET（SmFRET）。

2.1.3 應用

FRET在活細胞中的應用非常之多，即利用兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息以回答分子運動、蛋白構象、轉錄調控等相關生物學問題。技術上，主要通過顯微鏡，利用受體漂白、導致的供體熒光增強、供體熒光漂白、受體熒光壽命增長、供-受體熒光強度比率法等多種手段來檢測FRET現象，在此介紹部分代表性研究。

（1）活細胞內生理狀態下的離子檢測是FRET技術較為經典的應用。例如，Myawaki等發展了一種由CFP、YFP、鈣調蛋白和鈣調蛋白結合肽M13組成的活細胞鈣離子指示劑。其原理是，細胞里的Ca2+促進鈣調蛋白與M13結合，進而增加了熒光蛋白之間的熒光共振能量轉移，因此可通過檢測FRET現象和數據校正，實現細胞器中鈣離子的監測與定量。無獨有偶，Zhang等利用FRET探針對活細胞中Hg2+進行了高靈敏檢測。另外，針對活細胞中ATP、pH值等重要生理參數，均有巧妙的FRET示蹤體系被相繼報道。

（2）FRET無疑是研究蛋白質互作的最好手段之一。蛋白質-蛋白質相互作用涉及生命體中眾多生理過程和信號轉導過程，在細胞活動中扮演關鍵性角色。利用FRET技術檢測蛋白質互作的策略通常是利用基因操縱，將兩個目標蛋白分別偶聯一個供體或受體，并在細胞內融合表達。在特定時空及生理條件下，如果存在互作，供體和受體會相互靠近產生FRET現象，反之則無。利用這一策略，細胞中多種蛋白之間的互作已被鑒定和示蹤。例如，高遷移率族蛋白1（HMGB1）、Toll樣受體（TLR）與晚期糖基化終產物受體（RAGE）之間的相互作用；亞細胞結構中表皮生長因子受體（EGFR）與和其結合蛋白Grb2之間的互作；基質相互作用分子1（STIM1）之間的寡聚化及其易位、靶向等。

除此之外，FRET也普遍用于活細胞中RNA檢測、蛋白質動力學等相關研究。

2.2 生物發光共振能量轉移

BRET于1999年問世，與FRET基本原理相似，有異曲同工之妙。BRET體系中的供體主要是熒光素酶（Luc）。其中，海腎熒光素酶（Rluc）以腔腸素（Coelenterazine）為底物，螢火蟲熒光素酶（Fluc）以DLuciferin和ATP為底物，海螢熒光素酶（Cluc）則以海螢熒光素為底物，這些均是BRET常用供體。如圖3所示，這些底物及其衍生物會被相應的熒光素酶催化并氧化發光。由于A-B分子的相互作用，供受體相互靠近。當兩者距離1～10 nm時，BRET現象產生，受體發光。底物飽和狀態下，受體熒光強度與酶濃度呈正相關。較FRET比，由于BRET無須外界光源激發供體，因此可避免強光源導致的光漂白、光吸收、組織損傷等現象，同時能夠降低因生物體內自發熒光產生的背景信號。

在活細胞影像的應用方面，BRET和FRET大致相同，如蛋白質相互作用、ATP檢測、蛋白質活性測定等。值得一提的是，在富含血細胞或血紅色素的組織及活體成像中，由于生物體內光吸收、自發熒光的減少，使BRET在信噪比方面具有明顯優勢。

3 分子互補系統

分子互補系統是利用蛋白質片段互補技術構建的分子傳感體系。本文著重闡述的是以熒光蛋白為信號元件的分子互補系統，包括雙分子熒光互補（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、三分子熒光互補（trimolecular fluorescence complementation，TriFC）等。

3.1 雙分子熒光互補

3.1.1 原理

BiFC起源于蛋白質片段互補技術，由Ghosh等于2000年首次報道。熒光蛋白在特定區域（通常是loop區）通過基因剪接形成兩個非熒光片段，稱為N片段和C片段。N、C兩個片段通過Linker肽分別與一對相互作用的靶蛋白融合表達。由于靶蛋白對之間的相互作用，熒光蛋白N片段和C片段會緊密靠近，形成空間互補，進而發生分子重建恢復構象，并在合適的激發波長下產生熒光。反之，若靶蛋白之間不存在相互作用，則無熒光產生。

3.1.2 特點

BiFC可應用于體內和體外，具有高靈敏、低噪聲等特點。BiFC分子元件預先通過基因操縱導入細胞中表達，無須外源添加即可直接利用熒光觀測活細胞或活體中生物分子的相互作用及其空間位置信息，因此避免了外源物質對細胞的干擾和觀察的失真。與FRET和BRET技術相比，BiFC不用復雜的數據處理，常規熒光顯微鏡即可滿足。利用不同顏色的熒光互補系統，還可以在活細胞內同時檢測多個蛋白的相互作用。鑒于這些特點，BiFC被廣泛用于生物分子相互作用的研究，特別是細胞內之間、細胞與環境物質之間的相互作用。

目前所報道的BiFC系統通常不可逆、即結合重構后很難再被打開。這個特點使得BiFC靈敏度很高，可檢測KD接近1 mmol/L的弱相互作用，但也阻礙了BiFC監測蛋白質相互作用的動態變化。為此，Tchekanda等利用基因改造的近紅外熒光蛋白突變單體IFP1.4發展了可逆的BiFC系統，進一步擴展了BiFC技術的應用。

3.1.3 應用

BiFC常用于研究蛋白質寡聚化（protein oligomerization）。其中，α-突觸核蛋白（α-synuclein）的錯誤折疊——寡聚化和纖維化被認為是帕金森和其他相關神經疾病發生和發展的核心事件。Outeiro等通過BiFC直觀地觀察了突觸核蛋白在活細胞中的寡聚化，并發現蛋白寡聚化導致的細胞毒性增加可通過Hsp70來緩解。除此之外，G蛋白偶聯受體（GPCRs）的寡聚化是又一重要研究領域。GPCRs及相關信號轉導涉及諸多疾病，其寡聚化在調節受體藥理學和功能中具有重要作用。目前大約30%～40%藥物的細胞靶標針對GPCRs而設計。在該領域，有大量基于BiFC的研究與發現，包括GPCR二聚化和二聚化的抑制、腺苷A2A受體的分布和其在質膜上的組裝、利用GPCR二聚體成像研究神經肽YY1/Y5 受體異二聚體的藥理學等。Cirulela和Vilardaga更是詳細總結了BiFC在GPCR研究中的應用。因此，BiFC不僅是示蹤蛋白寡聚化的重要工具，更是尋找相關疾病治療靶標和藥物的有效手段。

BiFC也廣泛用于研究病毒與宿主之間的相互作用。這些研究對于理解病毒的生命周期和致病機制具有重要意義。例如，Hemerka等利用BiFC揭示了流感病毒聚合酶復合物PA與PB2亞基之間前所未知的相互作用，并對PA-PB2二元復合物的亞細胞定位與進核進行了詳細分析，其研究思路為進一步探索PA-PB2互作與甲型流感病毒聚合酶活性、病毒復制的生物相關性提供了一個框架。目前，利用BiFC對人類病毒的研究還涉及Epstein-Barr病毒潛伏膜蛋白1的表征、基于Beclin1-Bcl2復合物解離的自噬抑制劑藥物篩選、HIV病毒非結構性蛋白Vpr分子之間的互作等。

3.2 分子互補系統的發展

3.2.1 遠紅外和近紅外BiFC

在哺乳動物中存在細胞成像的近紅外（NIR）光學窗口（650～900 nm），以避免生物體內水、血紅蛋白等分子對光的吸收。為了解決這個問題，筆者團隊利用mCherry（λex/λem＝587 nm/610 nm）、mNeptune（λex/λem＝600 nm/650 nm）等熒光蛋白開發了系列長波長熒光分子互補系統。另外，為了更好地實現深部組織成像，我們打破利用GFP-like熒光蛋白構建BiFC這一常規，創新性的發展了以細菌光敏色素iRFP為基礎的近紅外BiFC系統（λex/λem＝690 nm/713 nm）。該工作為生理條件下研究蛋白質相互作用提供了強有力工具，同時也為活細胞中的藥物評價提供了新策略。

3.2.2 三分子互補系統

鑒于細胞內未知的蛋白質-RNA之間互作，基于BiFC建立的TriFC系統應運而生。在TriFC系統中，熒光蛋白的C片段通過已知蛋白質（A′）和RNA（D）之間的相互作用，附著于報告mRNA。N片段與RNA-結合蛋白B′融合表達。如果RNA結合蛋白與報告基因mRNA中的靶序列相互作用，則N和C兩片段緊密接近，恢復熒光蛋白構象產生熒光。TriFC不僅可用于鑒定RNA-蛋白質相互作用，還可分析活細胞中RNA-蛋白質相互作用的定位和動力學。大量研究已驗證該方法的實用性。其中，筆者團隊利用TriFC重點研究了流感病毒和HIV病毒mRNA與宿主蛋白之間的相互作用，并闡釋了相關生物學機制。

最近，筆者團隊還發展了三片段熒光互補系統（three-fragment fluorescence complementation，TFFC），用于蛋白三聚體的成像研究。我們把具有光轉換和光激活特性的熒光蛋白mIrisFP拆分為3個片段，結合超分辨成像，在單分子水平示蹤了活細胞中G蛋白三聚體亞基間的相互作用。除此之外，在熒光蛋白第10個和第11個β-strand之間“切割形成的分子互補系統”（splitfluorescent proteins complementation）也被用于活細胞可視化研究，如蛋白質的定位、胞漿肽的輸送等。

4 結語與展望

近20年來，上述以熒光為信號的分子生物傳感技術進展迅速，大量相關研究論文被發表，涵蓋了材料、化學、物理、生物醫學、生命科學等多個學科。從活細胞層面的應用態勢來看，利用多色標記，結合超分辨成像，在單細胞、單分子水平實時動態觀察多個關鍵分子事件將成為主流。但是，這些分子生物傳感器在組織、器官和活體的深層次應用仍然面臨嚴峻挑戰。提高信噪比、避免生物物質光吸收、允許長時示蹤都還是難題。亟待創造生物相容性好、亮度高、抗淬滅熒光探針，提出超高靈敏傳感新體系，改進成像數據算法，也需要進一步推動光學技術、成像工具的發展等。隨著技術進步，分子生物傳感器將使我們前所未有地實時觀察獲取生命過程深層次信息，從而回答一系列重要的生命科學基本問題，并將拓展到臨床應用，為人類健康服務。