冷凍電子顯微學
——2017年度諾貝爾化學獎成果簡析

2018-02-08 19:05:48王宏偉

中國學術期刊文摘 2018年2期

王宏偉

2017年10月4日，諾貝爾化學獎評獎委員會宣布，將2017年的諾貝爾化學獎授予3位科學家，表彰他們在發展利用冷凍電子顯微學技術解析溶液中生物大分子高分辨率結構方面做出的開創性貢獻。這3位科學家分別是瑞士洛桑大學教授Jacques Dubochet，美國哥倫比亞大學教授Joachim Frank以及英國MRC分子生物學實驗室教授Richard Henderson。

1 冷凍電子顯微學的發展歷程

“Seeing is believing”。自從列文虎克發明光學顯微鏡以來，人類可以觀察生命體的微觀結構，并促成了一系列生物學中的重要發現。現代生物學的研究對微觀精細結構的觀察提出了更高的要求。這是因為，生物體的各種生命活動的機制是由其組成成分之間的空間關系與變化情況決定的；對于細胞及生物大分子結構的認識和理解能夠讓研究者們對生命過程有更深層次的認知。因而，對細胞結構及生物大分子的精細結構的揭示，已經成為現代生物學發展的本質需求以及主要推動力。

光學顯微鏡受限于可見光波長的衍射極限，能夠實現的分辨率有限，主要在200 nm附近。過去十幾年發展起來的超高分辨率光學顯微鏡技術已經可以達到10 nm的分辨率，但是仍然無法看到分子內的精細結構。20世紀初，德國學者H.Busch提出可以利用電子束在電磁場中的偏轉性質進行成像，1931年德國科學家Ernst Ruska（1986年度諾貝爾物理學獎獲得者）發明了透射電子顯微鏡，開辟了應用電子光源觀察微觀世界精細結構的時代。在透射電子顯微鏡中，電子槍產生的電子在高壓電場中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內部運動。根據高速運動的電子在磁場中發生偏轉的原理，透射電子顯微鏡中的一系列電磁透鏡對電子進行匯聚，并對穿透樣品過程中與樣品發生相互作用的電子進行聚焦成像以及放大，最后在記錄介質上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像，從而獲得樣品的精細結構信息。

應用透射電子顯微鏡觀察生物樣品需要克服3個技術難點：1）高真空的顯微鏡內部環境與生物樣品在水化環境中的矛盾；2）生物樣品主要由輕元素組成，易于受到高能電子的輻照損傷；3）生物樣品的輕元素組成與電子的相互作用較弱，導致成像的襯度低。在20世紀中葉，生物學家開發了一系列技術來繞過上述問題，通過對生物樣品進行固定、包埋、切片以及重金屬染色等過程，使得應用透射電子顯微鏡觀察細胞精細結構成為可能，并因此發現了許多重要的細胞器，如葉綠體、高爾基體、線粒體、核糖體、內質網、細胞膜、中心體和細胞骨架等。但這樣制備的生物樣品都是處于脫水狀態的，是對附著于生物大分子表面的重金屬染料成像，而不是對生物大分子的直接成像，因此無法保持和獲得生物樣品中的生物大分子高分辨率結構信息。

如何在透射電子顯微鏡內觀察含水狀態的生物樣品并獲得高分辨率的結構信息，成為20世紀70年代部分科學家試圖努力解決的科學問題。Donald Parsons提出應用較低真空的樣品臺保持一定的水分從而在透射電鏡里觀察生物樣品。Richard Henderson與Nigel Unwin采用葡萄糖包埋技術替代水分首次解析了細菌視紫紅質蛋白二維晶體的7 ?分辨率的三維結構。Robert Glaeser與Kenneth Taylor發現將catalase蛋白的薄晶體冷凍在近液氮溫度下，可以大大減少電子的輻照損傷，保持了蛋白質的高分辨率結構信息。Jacques Dubochet研究組根據Robert Glaeser實驗室發現的原理對快速冷凍水溶液的過程進行了深入的研究，發明了將含有生物大分子的溶液迅速冷凍于液氮溫度下的實用技術，并首次在透射電子顯微鏡內觀察到了快速冷凍在無序冰中的病毒顆粒。Jacques Dubochet發明的方法因為降溫迅速（～10000℃/s），可以將生物大分子在溶液中的結構狀態迅速固定；液氮溫度下無序冰的蒸汽壓遠低于透射電子顯微鏡內部的真空氣壓；液氮溫度可以降低高能電子對生物大分子的輻照損傷，因此，Dubochet方法解決了透射電子顯微鏡觀察含水生物樣品的關鍵技術瓶頸。在透射電子顯微鏡中保持冷凍樣品的低溫狀態也是若干科學家努力解決的技術難題，其中包括Richard Henderson在1990年代設計的采用Dewar罐保持樣品處于液氮溫度下的冷凍樣品桿，Yoshinory Fujiyoshi發明的直接對透射電鏡中樣品臺進行低溫冷卻的技術。后者的技術甚至可以實現將樣品的溫度降低到液氦的溫度下（絕對溫度-269.15℃）進行透射電子顯微學觀察，從而進一步降低高能電子的輻照損傷。這種利用低溫制備樣品及進行透射電子顯微鏡觀察的技術在過去的30年里日臻成熟，成為現在普遍使用的冷凍電子顯微學技術（簡稱“冷凍電鏡”）。

2 生物大分子三維重構技術的發展

透射電子顯微鏡的成像是電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。生物大分子的三維結構信息則隱藏在分子沿不同角度的二維投影中。1968年，Aaron Klug（1982年度諾貝爾化學獎獲得者）發現了中心截面定理，提出了三維物體沿一個角度的二維投影的Fourier變換等同于三維物體Fourier變換的一個與投影角度垂直方向的中心截面。因此如果可以確定一個分子結構多個不同角度二維投影之間的相對空間關系，即可以在Fourier空間中獲得多個中心截面的疊加；當投影角度數目足夠多時，即可以填滿Fourier三維空間，從而實現分子結構的三維重構（reconstruction）。根據這一原理，利用透射電子顯微鏡采集生物樣品多個角度的放大電子顯微圖像，即可能在計算機里重構出它的三維空間結構。

根據中心截面定理，具有螺旋對稱的分子組裝體系其單張電子顯微鏡照片即包含了分子多個不同角度的二維投影，因此可以利用螺旋對稱性質重構出三維結構。Aaron Klug最初就是對具有螺旋對稱性的噬菌體桿狀尾部電子顯微鏡照片進行了三維重構，在隨后的幾年里又對具有螺旋對稱性的TMV、微管等應用電子顯微學進行了三維重構。Richard Henderson與Nigel Unwin利用高度有序的二維晶體，通過獲得二維晶體的不同傾轉角度的電子顯微照片與電子衍射圖，首次實現了二維晶體的三維重構。隨后，Richard Henderson致力于改進解析二維晶體的計算機軟件算法和提高二維晶體的冷凍電鏡圖像與衍射圖譜質量，于1990年首次實現了應用冷凍電子顯微學解析蛋白質分子的原子分辨率結構，即細菌視紫紅質的3.2 ?分辨率三維重構。Nigel Unwin則致力于對乙酰膽堿受體所形成的螺旋排列管狀晶體的結構進行解析，并開發了一系列螺旋三維重構的算法，并最終解析出了該蛋白的近原子分辨率三維結構。具有正二十面體對稱性的病毒顆粒只需要較少的幾個方向的投影照片，也可以利用中心截面定理進行三維重構。

對于絕大多數生物大分子，尤其是生物大分子復合體，并不具備高對稱性，也不容易形成螺旋對稱性或二維晶體的有序排列。這些分子在溶液中處于分散分布的狀態，當制備了電子顯微鏡樣品后，各個分子以隨機的取向分布在樣品中，稱為單顆粒。Joachim Frank從20世紀70年代起，開始致力于對這種狀態的分子結構進行電子顯微學解析，從而開發了單顆粒三維重構算法。單顆粒重構的一個重要假設是分散分布于溶液中的同一種生物大分子具有相似的結構，因此它們的電子顯微鏡照片可以被認為是同一種三維結構的不同角度的投影。因為生物大分子在樣品中的包埋介質形成的背景噪音，以及為了減少高能電子對樣品的輻照損傷所采用的很低電子劑量的成像條件導致信號很弱，生物大分子的電子顯微照片的信噪比很低，是不能用單顆粒的照片直接獲得可靠的三維重構的。Joachim Frank開創性地將統計學方法引入到電子顯微鏡圖像分析中，通過對多個單顆粒的圖像進行統計分析，并通過對正、加和平均等圖像操作手段從多個顆粒圖像中提取信號，提高信噪比。Joachim Frank以及Marin van Heel各自領導的研究組又發展了一系列方法，可以確認高信噪比的二維圖像之間的空間投影關系從而獲得正確的三維重構。這些方法包括等價線方法、隨機圓錐重構法、隨機初始模型迭代收斂重構等方法。Joachim Frank組開發的軟件SPIDER以及Marin van Heel組開發的軟件IMAGIC成為最早進行單顆粒三維重構的軟件包。從1986年Joachim Frank組獲得第一個50 ?分辨率的核糖體的三維重構到2000年獲得10 ?分辨率的核糖體三維重構，單顆粒重構技術逐漸被冷凍電鏡領域所接受。Steven Ludtke開發了較為方便的圖形操作界面EMAN，進一步推動了單顆粒技術的應用。利用冷凍樣品，Tony Crowther 與Alasdair Stevens等采用類似的單顆粒重構原理開始對正二十面體病毒顆粒的冷凍電鏡照片進行三維重構分析，在1996年同時獨立解析了乙肝病毒衣殼的亞納米分辨率結構。Nikolaus Grigorieff，Z.Hong Zhou和Wah Chiu領導的研究組分別在2008年解析了正二十面體病毒的原子分辨率結構，首次證明了單顆粒技術可以作為完全獨立的結構生物學手段解析生物大分子復合體的原子模型。

3 冷凍電鏡硬件技術的革命性突破

冷凍電子顯微鏡的技術進步離不開顯微鏡本身硬件的發展。在過去的幾十年中，主要的透射電子顯微鏡廠家（FEI、JEOL、Zeiss等）一直在努力提高冷凍電子顯微鏡的機械及光學穩定性、自動化程度以及冷凍樣品的特殊需求性能等指標。不斷改進的透射電子顯微鏡儀器為冷凍電子顯微學技術的發展提供了堅實的保障，也為革命性技術的誕生奠定了良好的基礎。冷凍電子顯微鏡的高分辨率圖像采集設備的技術革新是冷凍電鏡過去10年來最重要硬件技術突破之一，直接導致了冷凍電鏡技術在分辨率水平上的迅速躍遷。

傳統的電子顯微學圖像采集介質一直使用基于化學感光的黑白底片，然后經過復雜的顯影、定影等過程后使用專門的掃描儀將電子顯微照片數字化之后在計算機里進行圖像處理。從20個世紀末開始，CCD相機（電荷耦合元件，將高能量的電子信號通過熒光板先轉變為光信號，再將光信號通過光纖傳導至半導體芯片上轉變為數字信號）開始被應用于電子顯微鏡的圖像采集系統。相比于底片，CCD相機的一個優勢是可以實時獲得數字化的電子顯微圖像，從而使得對圖像質量的評估以及樣品采樣的效率大大提升，并促成了初步的冷凍電子顯微學自動化軟件的誕生（Leginon，SerialEM，AutoEMation等）。但是CCD的缺陷是其高分辨率信息丟失嚴重，導致DQE（detective quantum efficiency，探測量子效率）在圖像高頻區域的顯著下降，比底片記錄的數據的質量差很多。

2005年，A. R. Faruqi和Richard Henderson提出可以使用基于CMOS（互補金屬氧化物半導體）技術開發的直接電子探測裝置來提高電子顯微鏡圖像采集設備的DQE。2005同年，第一個對電子直接進行探測成像的采集設備Direct Detection Device在美國San Diego實驗室誕生，可以進行高速成像，從而實現對樣品的不間斷連續采樣。2011年和2012年，Nikolaus Grigorieff和Bridget Carragher首次應用Direct Electron公司生產的DDD相機拍攝了處于液氮溫度下病毒冷凍樣品的電子顯微電影，并發現在液氮溫度下冷凍樣品的漂移現象可以通過對電影中不同幀之間的變化情況分析及后處理來進行校正，從而極大地提高獲取高質量圖像的成功率。2013年，兩篇工作獨立地報道了應用直接電子探測裝置獲得大分子復合體原子分辨率的三維重構。在一個工作中，英國MRC分子生物學實驗室的Sjors Scheres和Richard Henderson研究組與FEI公司合作開發了Falcon相機，通過拍攝連續電影及后續的圖像處理，解析了核糖體的原子分辨率結構。在另一個工作中，UCSF的David Agard和Yifan Cheng研究組與Lawrence Berkeley National Laboratory的Peter Denes研究組協同美國的Gatan公司開發了K2相機，實現了單電子計數成像技術，并通過拍攝連續電影及后續的圖像處理，解析了20S蛋白酶體復合體的原子分辨率結構。2013年12月《Nature》上發表了Yifan Cheng研究組與David Julies研究組應用最新型的K2相機對結構完全未知的膜蛋白TRPV1利用冷凍電鏡單顆粒三維重構技術解析出來的原子模型，標志著冷凍電鏡技術全面進入原子分辨率時代。這些最新的研究成果同時應用了Sjors Scheres開發的基于概率論的單顆粒三維重構分析算法及其程序Relion。這種基于概率論的單顆粒三維重構算法原理最早由耶魯大學的Frederick Sigworth教授于1998年提出，由Sjors Scheres完善并開發成為實用的圖像處理軟件，今天已經成為冷凍電鏡單顆粒結構解析的主流軟件包。

如今，冷凍電鏡單顆粒重構技術已經成為結構生物學的主流方法，眾多過去應用其它結構生物學手段無法解析的重要生物大分子復合體的結構被解析出來，如剪接體、光系統-捕光復合物超復合體、呼吸鏈超復合體和藻膽體。有越來越多的研究組利用冷凍電鏡技術去嘗試無對稱性，低分子量和柔型較大的生物大分子或復合體。目前能夠利用冷凍電鏡技術解析的最高分辨率是1.8 ?（GDH），而能夠成功解析到近原子分辨率的最小生物分子是64 kD的血紅蛋白。

4 中國冷凍電鏡的發展及現狀

中國科學家從20世紀90年代開始從事冷凍電鏡的研究工作。其中，清華大學隋森芳領導的課題組在磷脂單層膜上生長蛋白質的二維晶體，并利用透射電鏡來研究這些蛋白的結構以及它們與膜的相互作用。中國科學院生物物理研究所的徐偉開始研究膜蛋白的二維晶體。中山大學的張景強與湘潭大學的楊奇斌利用冷凍電鏡技術解析病毒的結構。材料科學領域的郭可信與李方華也開始開展冷凍電鏡的研究工作。這些研究組嘗試著自己開發搭建相應的硬件和軟件工具來進行開創性的研究，并發表了若干篇全部在國內完成的冷凍電鏡研究論文，同時也培養出了中國第一批從事冷凍電鏡研究的青年學生。

自2000年以來，隨著國家開始投入更多的資源升級電鏡設施，并加大科研經費的支持力度，一些經過良好訓練的年輕科學家回到中國，建立了一批冷凍電鏡實驗室，開始了他們的獨立研究工作。這些實驗室分布在清華大學、北京大學、中山大學、中國科技大學、浙江大學、上海科技大學、南開大學、復旦大學、廈門大學、中國科學院生物物理研究所、北京生命科學研究所、上海生物化學與細胞生物學研究所、上海藥物所等學術機構。中國冷凍電鏡研究的群體逐漸成長、成熟，高速的發展吸引了全世界科研界的關注。如今，中國從事冷凍電鏡開發與應用研究的課題組已經超過40個，形成了近500人的中國冷凍電子顯微學分會，在國內正在建設10多個大型冷凍電鏡平臺設施，并在過去的幾年中發表了幾十篇國際一流水平的科研成果，為世界矚目。

5 冷凍電鏡的技術難點與未來發展趨勢

1）樣品制備技術。樣品制備已經成為冷凍電子顯微學結構解析的限速步驟。冷凍電子顯微學要成為結構生物學研究的主要應用手段，必須在樣品制備這一步驟取得重要的突破。類似地，對于細胞結構研究來說，將本身很厚的細胞樣品進行減薄處理，才適合冷凍電鏡觀察。在過去的10多年里，冷凍切片技術一直在穩步發展，至今已經成為相對成熟的技術，但是對該技術的熟練掌握仍然需要長期的培訓與實踐經驗。最近發展起來的聚焦離子束減薄技術在未來可能會對冷凍細胞樣品的結構研究帶來新的契機。

2）高分辨率結構的分析與建模。應用冷凍電子顯微學技術在過去的兩年里所獲得的近原子分辨率（4 ?以上）三維結構的數目幾乎超過了前面幾十年所獲得的高分辨率結構數目之和。更多的在4～8 ?分辨率范圍內的結構在很短時間內被解析出來。不同的分辨率結構可以揭示出的結構細節亦不同。而與晶體學手段不同，冷凍電子顯微學單顆粒重構無法通過對晶格衍射點的信號強弱來判斷分辨率。如何客觀地對三維重構的結果進行檢驗、對結構解析分辨率進行明確的確定是目前高分辨率冷凍電鏡研究中的重要問題。在此基礎上，需要對不同分辨率水平的三維重構進行原子模型的構建，從而實現在原子水平上對分子功能的解釋。對于分辨率在4 ?以內的三維重構基本可以應用X射線晶體學現有的方法進行建模。對分辨率在4 ?以外的三維結構如何建立較為可信的模型，則仍缺少相對成熟并被普遍接受的方法。一些研究組正在利用同源建模、分子動力學模擬等手段來進行這一分辨率水平的原子模型搭建的嘗試。

3）構象不均一性的分析。冷凍電子顯微學單顆粒結構解析技術與晶體學技術的一個重要差異是不需要溶液中的生物大分子形成高度有序的晶體排列，因而可以直接獲得溶液中的生物大分子結構。但生物大分子尤其是大分子復合體本身的構象柔性因此沒有被固定在晶體結構中。這些構象柔性反映在電子顯微圖像中，常常是導致三維重構無法獲得高分辨率結構的根源。將不同構象的分子分開分析，是提高重構分辨率的重要過程。此外，分子在溶液中的不同構象很可能反映了分子發揮功能的不同結構形態，理解這些構象差異對于解釋分子功能的機制非常重要。目前對生物大分子構象不均一性的分析是冷凍電子顯微學結構解析中的技術難點和熱點。對這個問題的解決需要更多的新思路和新算法。

4）電子光學新技術方法在生物樣品研究中的應用。材料科學超高分辨率研究在過去十幾年里也出現了很多重要的技術進步，主要是電子顯微鏡光學系統的不斷完善和提高，以及新的成像手段的進步。新的技術諸如球差矯正、色差矯正、掃描透射電子顯微鏡系統等都在材料科學領域結構分辨率的顯著提高中發揮了重要作用。目前，利用最新的電子光學成像系統，物理學和材料科學研究者已經可以獲得0.5 ?的分辨率。隨著對生物樣品近原子分辨率結構解析能力的逐漸普及，更高的分辨率必然成為冷凍電子顯微學發展的下一個目標。如何應用材料科學領域證明對超高分辨成像卓有成效的電子顯微學方法來提高生物樣品的結構解析分辨率，使所有冷凍電子顯微學家面臨著新的機遇和挑戰。此外，新的技術如電子顯微鏡相位板（phase-plate）的開發與應用已經被證明對于利用單顆粒技術解析小分子量的蛋白質結構以及利用電子斷層掃描三維重構技術研究細胞結構具有重大的促進作用。該項技術很可能在未來幾年里引起冷凍電子顯微學的另一次新的重大突破。