異軍突起的冷凍電鏡技術
——2017年度諾貝爾化學獎成果簡析

雷建林

2017年10月4日，瑞典皇家科學院宣布2017年度諾貝爾化學獎授予對冷凍電鏡技術發展做出原創性貢獻的3位科學家，他們分別是瑞士洛桑大學的退休榮譽教授Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學的Joachim Frank教授和英國劍橋MRC分子生物學實驗室的Richard Henderson教授。

1 異軍突起的冷凍電鏡技術

結構決定功能，無論是宏觀大到宇宙的天文，還是微觀小到細胞內部的生命，莫不如此。生命科學從宏觀到微觀，即從器官、組織、細胞、細胞器到生物大分子等分子層面，其研究內容無不涉及到結構和功能的關系，這也是諾貝爾獎持續多次授予生物大分子結構解析的原因。X射線晶體學（X-ray crystallography）、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）和冷凍電鏡（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）三維重構（three-dimensional reconstruction，3DEM）是結構生物學的3大研究技術。X射線晶體學和核磁共振技術都有著先天性的一些缺陷，比如，X射線晶體學技術要求必須將樣品制作為晶體，生物分子尤其是分子量大的生物分子結晶非常困難，對溶液內樣品使用的核磁共振技術對樣品本身有限制，它只能應用于相對較小的蛋白質。冷凍電鏡技術有著其鮮明的優點：不需要結晶，溶液樣品通過快速冷凍方法包埋在一層玻璃態冰中更接近于其生理狀態，可同時獲得多個狀態的結構，可研究其動態的結構，所需樣品量極少。盡管如此，長期以來，X射線晶體學技術占據著絕對的統治地位。冷凍電鏡技術一直是這3大技術中最弱的一個，因其結構解析的分辨率低，甚至有時被嘲笑為blobology（只能看見一堆輪廓的技術），但一直在不停地進步著，結構解析分辨率逐漸提升，直到最后一個障礙被成功突破——直接電子探測器開始被用于記錄電鏡圖像，從而產生了質的飛躍。2013年底，加州大學舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測器K2相機和冷凍電鏡單顆粒技術解析了TRPV1膜蛋白3.4 ?近原子分辨率結構，一場冷凍電鏡技術掀起的結構生物學革命開始了，冷凍電鏡技術迅速取代X射線晶體學技術成為最重要的結構解析手段。

2 3位獲獎者在這一領域的突出貢獻

2013年之前，冷凍電鏡單顆粒技術其實已經相當成熟，正所謂萬事俱備，只欠東風，這也是為什么直接電子探測器研發成功投入使用之后，短短4年時間冷凍電鏡技術的應用就能迅速催生一系列重要的發現，以及諾貝爾獎如此快地青睞冷凍電鏡技術的原因。

冷凍電鏡技術的進步是過去幾十年眾多科學家共同努力的結果，這3位科學家的貢獻尤為突出，諾貝爾獎頒給他們自有其原因。

諾貝爾獎一向青睞原創的突破性技術，各種顯微成像技術也不例外。1953年荷蘭科學家Frits Zernike因發明相襯顯微鏡獲得諾貝爾物理學獎。最近的一次則是2014年Eric Betzig、Stefan W. Hell和William E.Moerner因開發超分辨率熒光顯微技術獲得諾貝爾化學獎。電子顯微鏡技術與諾貝爾獎也頗有淵源。1931年德國科學家Ernst Ruska和Max Knoll制造了世界上第一臺透射電鏡，因其在電子光學領域的基礎性工作，Ruska和掃描隧道顯微鏡的研制者Gerd Binnig及Heinrich Rohrer一起分享了1986年度諾貝爾物理學獎。準晶的發現也要歸功于透射電鏡。1982年，以色列科學家Dan Shechtman在急冷的鋁錳合金中發現5次對稱的電子衍射花樣，后來被證明為來自于急冷合成的二十面體準晶，他也因這項工作獲得了2011年度諾貝爾化學獎。世界上僅有美國Thermo Fisher Scientific（原FEI公司，生產基地在歐洲）、日本電子（JEOL）和日本日立（Hitachi）等知名企業能夠生產商業化的透射電子顯微鏡（注：德國蔡司Zeiss在這場革命來臨的前夜于2013年退出透射電鏡的制造領域）。電鏡在材料研究領域應用非常成功，比較容易獲得原子分辨率的結構，但在生物學領域的應用要明顯落后于材料科學，原因在于電鏡必須在高真空下才能工作，而生物樣品含有水分才會穩定，水分的揮發會破壞其真空。因此傳統的生物電鏡采用負染技術，即讓重金屬鹽包被蛋白表面，然后脫水干燥制作成適合在真空成像的樣品。1968年，英國劍橋MRC分子生物學實驗室的Aaron Klug博士和其同事David DeRosier提出了電鏡三維重構原理，并用于解析負染的噬菌體病毒的結構。Klug博士因此榮獲1982年度諾貝爾化學獎。然而負染的方法并不適合，不僅會導致樣品分辨率降低，更重要的是當生物分子失水后，它們的結構將坍塌，喪失自然結構特征。因此，必須解決生物樣品脫水失活的問題以及不耐電子輻照損傷的問題。

加州大學伯克利分校Lawence Berkeley國家實驗室的Robert Glaeser和他的學生Kenneth Taylor于1974年首次嘗試了將生物大分子過氧化氫酶的二維晶體進行冷凍并觀察到3 ?的原子分辨率的電子衍射花樣，說明通過冷凍的方法可以維持含水樣品的高真空以及有效降低輻照損傷對生物樣品精細結構的破壞。通常的冷凍過程中，樣品里的水會結成冰晶，可能使樣品結構發生改變。Jacques Dubochet系統研究了冰在各種冷凍條件下的狀態，1982年開發出真正成熟可用的快速冷凍制樣技術，使水在液態形式下固化，形成一種玻璃態冰而不是冰晶來包埋樣品。他們一開始嘗試用液氮直接冷凍但不成功，最后是用乙烷代替液氮后才最終實現，而乙烷本身則需要用液氮進行冷卻，這種方法一直被后來者沿用至今。這項工作標志著冷凍電鏡技術真正的開始。

冷凍電鏡技術主要包括3種不同的方法：單顆粒分析（single particle analysis），電子斷層術（electron tomography），電子晶體學（electron crystallography）。本次諾貝爾獎的頒發主要還是源于單顆粒分析技術最近幾年的廣泛應用催生了一系列重要發現。而Joachim Frank則是當之無愧的單顆粒分析技術鼻祖。1975年，Richard Henderson和Nigel Unwin提出了電子晶體學方法，但是二維晶體非常難以獲得。Joachim Frank開發了更加普適的單顆粒方法。生物大分子都是由輕元素構成，與高能電子相互作用較弱，同時還不耐電子輻照，不能接受很高的劑量，因此圖像的信噪比很低。Joachim Frank提出可基于各個分散的全同顆粒的二維投影照片，經過分類對位（alignment）及平均來降低噪音，從而獲取準確取向，最終得到更高分辨率的三維立體圖像。他還開發了冷凍電鏡第一個單顆粒三維重構軟件SPIDER。另外Joachim Frank將該方法應用于核糖體結構機理方面的研究并作出了重要開創性工作，可惜囿于當時冷凍電鏡結構解析分辨率不夠高，遺憾地與2009年授予核糖體結構解析的諾貝爾化學獎失之交臂。此次因單顆粒分析方法獲得諾貝爾獎，終于沒有再留下遺憾。

Richard Henderson是冷凍電鏡技術的引領者，1975年首次提出電子晶體學方法，用其獲得細菌視紫紅質7 ?分辨率的結構，并于1990年推進到3.5 ?。首次證明了利用冷凍電鏡技術是可以獲得原子級分辨率的，盡管只是二維晶體還沒有普適性。他1995年從理論上預言冷凍電鏡技術未來完全有能力解析到原子級分辨率，2004年進一步指出達到這個目標需要克服的關鍵問題，一是提高圖像的信噪比，二是克服圖像的漂移。其理論分析為冷凍電鏡技術的發展指明了方向，其中一個最重要的方向是直接電子探測器的開發。他還親自參與了Falcon直接電子探測器的研發。直接電子探測器的引入，解決了他指出的問題。Richard Henderson還獨具慧眼，提攜當時還不太知名的Sjors Scheres，將其引進至MRC分子生物學實驗室，后者開發的基于概率統計分析的三維重構軟件Relion能更有效地處理低信噪比的冷凍電鏡圖像。硬件與軟件的快速發展，掀起了結構生物學的一場革命。

3位獲獎者多次到中國進行交流訪問，其中Joachim Frank和Richard Henderson和中國頗有淵源。Joachim Frank實驗室有許多華人學生和學者，為中國培養了不少該領域的研究人員。北京大學的高寧教授2002—2006年跟隨Frank攻讀博士學位，2006—2008年又在其實驗室做博士后，隨后回到清華大學建立實驗室，后于2017年4月轉至北京大學工作。清華大學雷建林2000年11月—2009年2月在Frank實驗室先后做博士后和副研究員（associate research scientist），后回到清華大學協助建設國內首個頂級冷凍電鏡平臺，目前任清華大學冷凍電鏡平臺總管。北京大學醫學部教授尹長城早年在劍橋MRC分子生物學實驗室學習，其導師Nigel Unwin和Richard Henderson一起發展了電子晶體學方法。

3 中國冷凍電鏡領域發展現狀

在這場冷凍電鏡技術引起的結構生物學革命中，華人學者也做出了重要貢獻。從2008開始，在直接電子探測器問世之前，美國Brandeis大學Nikolaus Grigorieff研究組的張興博士（后加入周正洪研究組），德克薩斯大學休斯敦醫學院/加州大學洛杉磯分校的周正洪教授和他實驗室的余學奎、張興博士利用Kodak SO-163膠片或CCD相機解析了多個病毒近原子級分辨率的結構，最高的分辨率達到3.3 ?，這是首批利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出的生物大分子的原子結構。但是利用傳統的膠片或CCD相機只有病毒等個別具有高對稱的生物大分子有可能利用單顆粒方法做到原子級分辨率。2011年左右，一種全新的圖像記錄設備直接電子探測器開始揭開其神秘的面紗。2013年初，程亦凡課題組（第一作者李雪明博士）和英國MRC分子生物學實驗室的Sjors Scheres課題組（第一作者白曉晨博士）分別獨立發表論文，證明利用直接電子探測器并結合新的圖像處理工具可以解析生物大分子的原子分辨率結構。2013年底加州大學舊金山分校程亦凡研究組和David Julius研究組合作首次利用直接電子探測器和冷凍電鏡單顆粒技術解析了TRPV1膜蛋白3.4 ?的結構，一夜之間直接掀起了這一場結構生物學革命。李雪明、張興、余學奎博士分別回到清華大學、浙江大學、中國科學院上海藥物研究所組建獨立實驗室。

20世紀90年代中期，清華大學隋森芳教授、中山大學張景強教授、中國科學院生物物理研究所徐偉研究員等人開始利用冷凍電鏡開展研究。隋森芳院士是中國冷凍電鏡領域的先驅，不僅利用冷凍電鏡技術研究與生物膜相關的重要蛋白質復合物的結構與功能做出了非常重要的工作，還培養了一批冷凍電鏡領域的優秀青年科學家，這些科學家各自建立了獨立的實驗室，包括清華大學的王宏偉、上海科技大學的沈慶濤、西安交通大學的武一、天津大學的米立志、美國Wadsworth中心的劉錚、NIH的江健森、西南醫學中心的白曉晨和普渡大學的暢磊福。

中國早期的冷凍電鏡設備非常落后，2008年以前沒有一臺場發射冷凍透射電鏡。真正的發力開始于2008年，清華大學率先訂購亞洲第一臺Titan Krios高端冷凍電鏡，該儀器于2009年3月到貨，幾個月后中國科學院生物物理研究所的Titan Krios也到貨。其后，隨著國家蛋白質科學研究基礎設施的啟動，蛋白質科學研究（上海）設施以及清華大學分別在2013年和2015年第4季度各有1臺和2臺Titan Krios電鏡投入使用。近年，隨著冷凍電鏡技術的革命，中國科學院生物物理研究所、北京大學、浙江大學紛紛購置了Titan Krios電鏡并投入使用，更多的高校與科研機構也都已經或計劃購置高端冷凍電鏡。截止到2017年11月，中國將共有各種型號的冷凍電鏡近50臺，其中最高端的冷凍電鏡約14臺（含已到貨暫未完成安裝的）。到2018年年底，最高端冷凍電鏡的數字將可能增至近30臺。

近年來，在冷凍電鏡技術的應用方面，中國科學家取得了優異的成績。如，清華大學施一公研究組首次報道了通過單顆粒冷凍電鏡方法解析的酵母剪接體近原子分辨率的三維結構，并闡述了剪接體對前體信使RNA執行剪接的基本工作機理；隨后又陸續解析了酵母剪接體多個處于不同狀態的結構；2017年施一公課題組又首次解析了人源剪接體近原子分辨率的三維結構。清華大學隋森芳課題組獲得了第一個完整藻膽體的近原子分辨率的三維結構，也是迄今為止報道過的分辨率好于4 ?的最大的蛋白復合體結構。清華大學顏寧課題組解析了一系列不同的離子通道的冷凍電鏡結構。清華大學楊茂君課題組解析了一系列線粒體呼吸鏈蛋白質復合物的結構。中國科學院生物物理研究所朱平研究組和李國紅研究組合作解析了30 nm染色質左手雙螺旋高清晰三維結構。中國科學院生物物理研究所柳振峰研究組、章新政研究組與常文瑞、李梅研究組合作，先后報道了菠菜和豌豆光系統-捕光復合物的超級膜蛋白復合體的高分辨率電鏡結構。中國科技大學的蔡剛課題組解析了3.9 ?分辨率的ATRATRIP復合物的結構，該結構揭示了ATR激酶活性在同源二聚體中活性抑制和激活的分子機制。

在冷凍電鏡技術的開發方面，中國科學家也取得了一系列成果。如，清華大學的王宏偉課題組和合作者首次提出并使用過焦成像技術獲得高分辨率蛋白質結構，是冷凍電鏡成像理論方面的新方法，同時此方法也為球差矯正技術和相位板技術在生物冷凍電鏡領域的應用提供了新思路。清華大學的李雪明課題組和合作者開發了基于深度學習技術的自動挑顆粒軟件DeepPicker、單顆粒重構軟件Thunder以及單顆粒、微晶衍射（MicroED）數據收集軟件。清華大學王佳偉和其合作者開發了為高分辨率冷凍電鏡三維重構密度圖自動建模的程序EMBuilder。清華大學的雷建林在原有開發基礎上，發展了全新的高通量單顆粒自動化數據收集軟件AutoEMation 2.0并廣泛使用。中國科學院生物物理研究所的孫飛和其合作者得出以下成果：1）提出了一種全新的高真空光學冷臺設計思想，自行研發了一套基于高真空光學冷臺的光電關聯成像系統HOPE；2）開發了連續超薄切片掃描電鏡成像AutoCUTS-SEM大尺度生物樣品電鏡三維重構新技術；3）提出了一種改進的冷凍聚焦離子束切割方法；4）開發了新型的電子斷層三維重構新方法。湖南師范大學的劉紅榮和其合作者提出了一種基于二維電子顯微圖像重構對稱失配生物大分子三維結構的新方法，首次揭示了病毒內部基因組及其聚合酶的三維結構。

華人科學家在這個領域的影響力越來越大，3DEM Gordon Research Conference是這個專業領域最重要的國際會議，2016年的大會主席是加州大學舊金山分校程亦凡教授，2019年將由清華大學王宏偉教授擔任。首屆Kuo KH International Symposium on 3D Cryo-EM Molecular Imaging于2008年由清華大學承辦，這也正式標志著中國冷凍電鏡群體的快速崛起。兩年一度的該研討會越來越成為該領域僅次于3DEM Gordon Research Conference的國際盛會，3位諾貝爾獎獲得者過去曾多次參加該會。下一屆將于2018年8月在杭州舉行，由浙江大學承辦，Joachim Frank教授早就明確表示將參加。2016年成立了中國生物物理學會冷凍電鏡分會，到目前為止，國內從事冷凍電鏡相關工作的課題組約有50個，相信今后幾年會員數會迅速增長。

4 展望

2015年《Nature Methods》將冷凍電鏡技術評為年度最受關注的技術，2017年冷凍電鏡技術獲得諾貝爾化學獎實至名歸。今后，冷凍電鏡單顆粒技術的應用必然會更加普及，對于重要生物大分子的結構解析課題組之間的競爭將更加白熱化。冷凍電鏡技術是一門交叉學科，相當多的本領域華人科學家來自于物理和材料等領域也證明了這一點。本次頒獎很多人笑言是物理學家為了解決生物學問題而獲得了諾貝爾化學獎。未來技術的發展需要生物、物理、化學、數學、計算機、材料、工程等領域的科學家通力合作。冷凍電鏡技術在未來仍有許多重要技術問題尚待解決。如：1）如何獲得生物大分子結構在細胞乃至組織原位的更接近生理狀態的精細結構信息？2）如何獲得生物大分子的動態結構信息？3）超大規模數據的快速處理，這需要更好的數據處理軟件和計算機硬件的共同發展。4）如何進一步提高結構解析分辨率，雖然相位板、能量過濾器、物鏡球差矯正裝置等新硬件設備的開發應用進一步推進了冷凍電鏡技術的極限，目前單顆粒技術仍然難以獲得好于2 ?分辨率的結構，除了需要更好的算法外，相關的電鏡和相機硬件設備需要更深入的開發應用。5）如何將冷凍電鏡技術與其它技術，如超分辨率熒光顯微技術、質譜技術、測序技術等有機整合。6）如何發展更加成熟的MicroED技術。冷凍電鏡領域目前人才缺口很大，冷凍電鏡技術在未來大有可為。■