冷凍電子顯微技術
——2017年度諾貝爾化學獎成果簡析

馬成英 高寧

2017年10月4日，諾貝爾獎組委會宣布將諾貝爾化學獎授予瑞士洛桑大學的Jacques Dubochet、美國哥倫比亞大學的Joachim Frank和英國MRC分子生物學實驗室的Richard Henderson，以表彰這3位科學家在冷凍電鏡技術發展中做出的重大貢獻。

1 冷凍電鏡技術的起源和發展

結構生物學技術是現代生命科學中的重要研究手段，通過解析生物大分子的高分辨三維結構理解它們之間如何互相作用，如何發揮各自的生物學功能。冷凍電鏡、X射線晶體學（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）構成了解析蛋白質高分辨結構的3種主要結構生物學手段。冷凍電鏡，即冷凍電子顯微技術（cryo-electron microscopy，cryo-EM），是在低溫狀態下，通過使用透射電子顯微鏡觀察冷凍樣品的一種顯微技術。根據樣品處理方式的不同，冷凍電鏡技術又可以分為電子晶體學、單顆粒重構技術和電子掃描斷層成像技術。伴隨冷凍電鏡硬件設備的發展和計算方法的改進，利用單顆粒重構技術已經獲得了大量的高分辨的蛋白質復合物結構。更為重要的是，這一方法可以解析傳統的蛋白晶體學和NMR技術難以處理的復雜生物樣品的高分辨結構，例如分子量相對較大的多亞基分子機器、膜蛋白復合物等。

電子顯微鏡誕生于20世紀30年代，隨后被廣泛的應用到生物樣品的二維形態表征中，很多重要的細胞生物學發現（例如細胞內各種細胞器）都是采用這一顯微技術。與此同時，也正是在X射線的晶體學技術的黃金發展時期，一整套的衍射理論和數據處理方法被逐漸建立。20世紀60年代，英國MRC分子生物學實驗室的Aaron Klug嘗試了將晶體學的理論和方法用于電子顯微鏡所拍攝圖片的處理，首次建立了基于電子顯微鏡所采集數據的三維重構技術。在這篇標志著“電鏡三維技術”誕生的劃時代論文當中，Klug和他的學生David DeRosier使用重金屬離子（比如醋酸鈾）對蛋白質進行染色，然后再使用透射電鏡進行數據收集，通過分析具有螺旋對稱性的T4噬菌體尾巴的電子衍射花樣，從而重構出其三維結構。這一早期的三維重構技術被稱為電子晶體學，這種技術要求樣品具有一定的周期性（對稱性），從而能夠產生特定的高信噪比的衍射花樣。電子晶體學方法隨后被用于多種生物樣品的結構解析，例如螺旋結構的樣品、病毒和二維晶體等。例如，1975年，Henderson和Unwin利用電子晶體學解析了分辨率為7 ?的第一個膜蛋白的三維結構：具有7次跨膜螺旋的細菌視紫紅質結構。Klug因其在電子晶體學的奠基性貢獻榮獲1982年度諾貝爾化學獎。

電子晶體學法在膜蛋白結構解析上的一個比較大的挑戰就是需要獲得比較規則的二維晶體。而高質量的二維晶體樣品的獲取在實驗上非常困難，這也導致了電子晶體學的廣泛應用受到了限制。另外一個限制因素是負染染料會對蛋白質結構造成破壞，而且大顆粒的重金屬染料也會影響最終三維結構的分辨率。1974年，Ken Taylor和Robert Glaeser利用冷凍的水化過氧化氫酶晶體獲得了高分辨電子衍射花樣，第一次在實驗上證明低溫可以有效的保持生物樣品的完整性及降低電子輻照損傷。接下來，Dubochet等在1980年發展了利用液態乙烷冷凍生物樣品并獲得玻璃態冰的方法，電子顯微技術從此進入了“冷凍”時代。這一冷凍技術很快在電子晶體學應用中帶來重大突破。例如，借助樣品冷凍，Henderson等在1990年將細菌視紫紅質的分辨率提升到了3.5 ?。一些其它的重要生物大分子復合物也通過電子晶體學的方法獲得了原子分辨率的結構，如植物捕光復合物、微管蛋白二聚體，及分辨率高達1.9 ?的水通道蛋白AQP0。

在電子晶體學方法發展的同時，以Joachim Frank為代表的科學家另辟蹊徑，提出可以通過收集大量的“全同”的生物大分子的二維投影照片，在數據處理階段合并這些大量的不同投影方向的照片從而獲得三維結構的方法。這一方法具有非常高的普適性，不需要生物樣品具有任何對稱性或者周期排列，其核心是可以通過計算機技術在數據處理過程中對二維投影照片進行分類平均以提高信噪比。這一技術就是冷凍電鏡技術中目前應用最為廣泛的單顆粒重構技術。在1980—2010年間，多個研究組加入到單顆粒技術的方法開發中，誕生了一系列各有特長的數據處理軟件，包括SPIDER、IMAGIC、EMAN、XMIPP、FREALIGN、RELION等。自2013年以來，伴隨冷凍電鏡硬件設備和計算方法的改進，單顆粒技術獲得了革命性的發展，已經有大量的原子分辨率的結構獲得解析。

2 3位獲獎者在這一領域的突出貢獻

Jacques Dubochet生于1942年6月，1973年獲得日內瓦大學和巴塞爾大學的生物物理學博士學位。1978年到1987年，作為組長任職于歐洲分子生物學實驗室。1987—2007年，作為教授任職于瑞士洛桑大學。Dubochet發展了快速冷凍技術以觀察生物細胞內的蛋白復合物或者純化的生物樣品。其早期主要貢獻是建立了將蛋白周圍的水溶液快速冷凍并使蛋白分子狀態保持自然狀態的方法。這一基于液態乙烷和液氮進行冷凍制樣并形成無定形冰（玻璃態冰）的方法一直沿用至今，在各種各樣的冷凍電鏡技術中扮演了非常重要的作用。Dubochet之后進一步發展了各種冷凍技術用于細胞制樣，推動冷凍制樣進入了更廣泛的應用。

Joachim Frank 1940年出生于德國，1970年在Walter Hoppe的指導下于慕尼黑工業術大學獲得博士學位，2006年當選為選為美國藝術與科學、美國國家科學院兩院院士，目前是哥倫比亞大學生物化學與分子生物物理學系教授。Frank是目前冷凍電鏡三維重構最常用的方法——單顆粒重構技術的創始人。Frank發展了處理不同取向的單顆粒大分子復合物的二維投影的方法，提出了單顆粒重構的思想，并開發了用于單顆粒三維重構的一系列計算方法和相關軟件SPIDER。1975年，Frank認識到“精確的發現并對位大量的模糊的單顆粒投影間的結構特征”是這一方法的核心環節，并且在后續幾十年的工作中持之以恒解決一個個的技術困難，發展了一些列用于二維單顆粒投影的分類、平均、三維重構的算法。同時，Frank最早利用冷凍電鏡解析了生物體內蛋白質翻譯機器核糖體的三維結構，對于核糖體的結構和功能的研究也做出了巨大貢獻。

Richard Henderson于1945年出生于蘇格蘭，MRC分子生物實驗室教授，于1983年當選英國皇家學會院士。1975年，Henderson與Unwin合作，利用電子晶體學首次獲得分辨率為7 ?的細菌視紫紅質的結構。這是首次觀測到膜蛋白的跨膜螺旋結構，也是首次利用該技術看清楚蛋白樣品的二級結構。1990年，經過10多年的努力，Henderson通過冷凍制樣最終解析了冷凍狀態下的細菌視紫紅質二維晶體結構，這也是冷凍電鏡技術所獲得的第一個原子分辨率的結構。除了這些早期的電子晶體學的貢獻，Henderson還在單顆粒技術發展的不同階段做出了重大的推動性工作。他最早通過理論分析指出了單顆粒方法獲得原子分辨率結構的各種限制因素，提出在合適的成像條件下，即使50 Kd大小的樣品的原子分辨率也可由數千張投影照片獲得。Henderson的另外一項重要貢獻是他和電鏡制造公司合作最早進行了用于冷凍電鏡數據收集的DDD相機的研發。目前冷凍電鏡高分辨數據的采集均使用DDD相機。

3 冷凍電鏡技術的研究進展

近幾年來，伴隨硬件設備和計算方法的改進，運用冷凍電鏡單顆粒重構的方法能夠得到原子分辨率的三維模型，用來進行生物大分子復合物組裝和功能的研究。冷凍電鏡三維重構的基礎是基于收集大量的不同取向的投影圖片。最早冷凍電鏡的圖片是使用膠片來記錄，但是需要對膠片進行顯影和數字化處理。隨后發展的CCD（charge-coupled device）相機能夠應用于自動化數據收集中，但是CCD采集照片首先是將電子信號轉變成光信號，然后再轉化成電信號進行檢測，這一信號轉換過程導致高分辨信息的損失，影響最終的分辨率。近幾年來，冷凍電鏡領域發生了幾個重要的革命性的技術突破，最主要的是電子直接探測相機（DDD，directelection detector）的發明。目前使用的金屬氧化物半導體感光元件（CMOS）能夠在1 s內獲得幾百張的圖片，通過對這些時序曝光的圖片進行漂移的矯正和疊加，能夠大幅度的保持圖片中的高分辨信息。例如，UCSF的程亦凡組開發了對整個照片的frame進行圖像漂移矯正的算法，并整合到了MotionCorr程序中，利用這些矯正算法，程亦凡和合作者David Julius組首次得到了分辨率為3.4 ?的膜蛋白TRPV1的三維結構。而在新型的DDD出現之前，基于冷凍電鏡單顆粒技術所獲得的高分辨率的結構只存在于高對稱性的生物樣品，其中代表性的科學家為UCLA的周正洪教授，他的課題組率先獲得了原子分辨率的病毒顆粒。

TRPV1高分辨結構解析之后，隨著DDD相機在世界各電鏡中心的大范圍推廣，大量的近原子分辨率的結構被解析出來，推動了結構生物學領域的技術革命。進一步的最新發展包括相位板（例如Volta Phase Plate）技術，使許多小蛋白的結構也能夠被解析出來。比如，Sexton等運用B類GPCR-G蛋白復合物的結構，Danev等解析了分子量僅為64 kDa的分辨率為3.2 ?的血紅蛋白的結構。此外，冷凍電鏡數據的高效分類算法也在這一輪技術革命中扮演了重要的不可缺少的角色，代表性人物為RELION的開發者SjorsScheres。

4 中國科研人員的相關研究情況

20世紀80年代，郭可信、李方華、馮瑞和王仁卉等中國科學家參與了早期生物電鏡技術的發展和應用。與此同時，國內許多優秀的青年科學家也積極到國外冷凍電鏡實驗室進行學習。20世紀90年代，國內的一些科研工作者也獨立開展了冷凍電鏡技術的研究，包括清華大學的隋森芳、中山大學的張景強及中國科學院生物物理研究所的徐偉。2008年，清華大學購買了國內第一臺高端冷凍電鏡Titan Krios，隨后中國科學院生物物理研究所和國家蛋白質科學中心（上海）也建立了以Titan Krios為核心的冷凍電鏡平臺，國內的冷凍電鏡學科發展自此進入了一個快速發展期。其中代表性的工作為2014年朱平組和李國紅組解析的30 nm染色體纖維結構。2014年之后，由于冷凍電鏡的相機設備的升級，國內多個研究組利用冷凍電鏡發表了優秀的高水平的文章。例如，施一公組解析了mRNA剪切體的結構，顏寧組解析了真核電壓門控的鈣離子通道結構，楊茂君組解析了人源的呼吸鏈超級復合物結構，隋森芳組解析了海洋紅藻藻膽體的結構，柳振峰組和章新政組解析了光系統II-捕光復合物II的超級復合體結構，顏寧組和高福組合作解析了埃博拉病毒感染受體NPC1的結構，高寧組獲得了核糖體組裝和翻譯調控復合物的高分辨結構，王宏偉組獲得了RNA代謝相關復合物的結構，尹長城組和孫飛組解析了開放態RyR1的結構，葉克窮組解析了核糖體組裝前體相關復合物的結構，張勤奮組和合作者對多種病毒的結構進行了研究，毛有東組解析了人源蛋白酶體26S的結構，徐彥輝組解析了DNA依賴的蛋白激酶復合物結構，向燁組利用冷凍電鏡和晶體學相結合的方法研究了噬菌體穿膜的機制，陳柱成組和李雪明組合作解析了染色質重塑復合物Snf的結構，柴繼杰組和隋森芳組解析了天然免疫通路的NLRC4多聚體結構，叢堯組解析了蛋白質折疊機器TriC/CCT等復合物的結構，陳雷組和高寧組合作解析了胰細胞來源的ATP敏感鉀離子通道結構，蔡剛組解析了DNA損傷應答相關的激酶復合物的結構。

同時，國內的冷凍電鏡方法學也獲得了長足進展。孫飛組和張法組長期合作，開發了一系列冷凍電鏡數據處理的軟件，李雪明組與曾堅陽組開發了基于深度學習算法的顆粒挑選軟件，劉洪榮組和程凌鵬提出了新的病毒顆粒重構算法，王宏偉組和雷建林合作實現了基于球差校正和相位板等新附件的數據收集新策略，王佳偉組開發了基于冷凍電鏡密度圖的自動建模軟件。

近年來，國內的冷凍電鏡發展進入了快車道，眾多單位投入資金購置高端冷凍電鏡。可以預期，在未來的幾年，會有一大批的具有國際影響力的方法學和應用的研究成果涌現。?