氣相色譜法檢測混合型飼料添加劑中的大蒜素和香芹酚

林茂發　黃永輝　胡朝陽　黃何何　高希

摘要：建立了對混合型飼料添加劑中大蒜素和香芹酚含量進行檢測的氣相色譜方法。樣品采用乙醇提取，經毛細管相色譜柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）分離，氫火焰離子化檢測器測定，外標法定量，并采用氣質確證。方法學研究結果表明，目標化合物二烯丙基二硫醚，二烯丙基三硫醚，香芹酚在0.01～10mg/mL濃度范圍內具有良好線性關系，相關系數為r≥0.9990，檢出限分別為10mg/kg、15mg/kg、10mg/kg；回收率為79.8～96.2%，相對標準偏差為2.61～4.73%。該方法前處理簡單，準確可靠，可以用于混合型飼料添加劑樣品中大蒜素和香芹酚的測定。

關鍵詞：飼料添加劑；大蒜素；二烯丙基二硫醚；二烯丙基三硫醚；香芹酚；氣相色譜法；氣質確證

我國是肉類產品的消費大國。人們消費的肉類產品主要是通過工廠化集約養殖的方式提供，工廠化養殖大多數采用配合飼料進行飼養，優質的配合飼料是養殖成功的基礎，飼料質量安全直接影響到肉類的質量安全，因此在提倡無公害養殖的同時飼料企業也在努力生產出安全、高效、環保的配合飼料，飼料添加劑作為配合飼料的重要組成是飼料企業投入大量科研開發的項目之一，好的飼料添加劑可以提高飼料的利用率，減少動物的發病幾率，促進其生長，實現養殖業的可持續發展。

飼料添加劑產業多年的發展，尤其是中醫中藥技術在飼料添加劑中的應用，大量以中草藥或者植物提取物為主要成分的綠色、高效的功能型飼料添加劑被開發出來并投入飼料加工及養殖中，并且飼料添加劑的類型也由單一的成分朝多種有效成分混合型的飼料添加劑發展，相對于種類繁多的飼料添加劑產品。質量監管部門提供的檢測方法顯得有些不足，這給飼料添加劑質量監管帶來許多不便，因此有必要對各種新型飼料添加劑的檢測方法進行開發和研究。

本研究的對象為大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑，大蒜素是大蒜的主要提取物。其主要成分為二烯丙基二硫醚（dialM disulfide，DADS）和二烯丙基三硫醚（diallvl trisulfide，DATS），大蒜素用于飼料中具有消炎殺菌、改善飼料適口性、提高飼料效率的作用，是農業部批準使用的飼料添加劑之一。目前大蒜素的主要檢測方法有：重量法、容量法、氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜一質譜法。香芹酚Carvacrol（2-甲基-5-異丙基苯酚）是我國農業部批準使用的飼料藥物添加劑牛至油的主要成分，其中香芹酚已證明有很強的抗菌活性，能增強動物體對營養物質的消化吸收能力，提高生長性能和飼料利用率，目前香芹酚的檢測方法主要有氣相色譜法和液相色譜法，但對同時檢測大蒜素和香芹酚的方法尚未見報導，本實驗開發出采用氣相色譜法（GC-FID）同時檢測飼料添加劑中的大蒜素和香芹酚，并對目標化合物采用氣相色譜串聯質譜法確證，實驗證明該方法準確快捷。可以用于該中飼料添加劑的檢測。

1實驗部分

1.1儀器與設備

氣相色譜儀帶自動進樣系統聯FID檢測器及配套工作站（日本SHIMADZU公司），石英毛細管柱（HP-5，30m×0.32mm×0.25um）美國Agilent公司，6890N/5973N氣相色譜一質譜聯用儀，美國Agi，lent公司：HP-5MS石英毛細柱（30m×0.25mm×0.25μm）美國Agilent公司，BT224S分析天平，德國Sartorius公司；XH-B旋渦混均器，江蘇康健醫療用品有限公司；探針式超聲波處理器（功率：450 W，昆山超聲儀器有限公司）

1.2材料與試劑

甲醇、乙醇、丙酮、正己烷均為分析純，香芹酚標準品純度大于99.0%（德國Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基二硫醚標準品純度大于98%（德國Dr.Ehrenstorfer公司），二烯丙基三硫醚標準品純度大于98%（德國Dr.Ehrenstorfer公司）。稱取一定量的標準品。用無水乙醇溶解轉移到容量瓶中，并逐級稀釋成實驗所需的濃度。再配制成相應濃度的混標。

1.3力怯

1.3.1色譜條件：進樣口溫度：250℃：色譜柱升溫程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃，保留5min。檢測器（FID）溫度280℃，載氣，氮氣（純度不小于99.999%）：燃氣，氫氣（純度不小于99.99%）；空氣（壓縮空氣）；氣體流量：柱流量，1.85mL/min；氫氣40mL/min；空氣400mL/min：尾吹氣，30mL/min；進樣量：1μL；分流比：20：1。

1.3.2樣品前處理

準確稱取樣品1克（精確至0.0001g），置于50mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，超聲10min后定容，搖勻。

1.3.3測定

在上述選定的色譜條件下，待儀器穩定后，進行標準溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2結果與分析

2.1色譜方法條件的選擇

分別取空白基質樣品，標準品和混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液，按所述色譜條件測定。結果空白基質樣品在目標化合物保留時間處無雜質峰干擾，見圖1，圖2和圖3，表明樣品中其他成分不干擾目標化合物測定，并且能夠在最短的時間實現目標化合物完全分離，方法特異性強，適用于混合型飼料添加劑大蒜素和香芹酚含量測定。

2.2方法的線性范圍及檢測限

將香芹酚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚標準系列溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）在上述的氣相色譜條件下進樣分析，以標準溶液濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標，擬合標準曲線，得到相應的線性回歸方程及相關系數，根據3倍噪比計算方法的檢測限。結果見表1

2.3方法的回收率和精密度

向空白基質樣品中分別添加I（5g/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三個濃度水平的混合標樣，每個水平進行6次平行測定，回收率和精密度結果見表2。endprint

2.4溶液穩定性試驗

按上述的前處理方法制備樣品溶液，按前述方法測定三種目標化合物含量，樣品溶液密封保存在室溫環境中，隔2h、4h、8h、24h、48h測定含量，結果見表3，結果表明樣品溶液在48h內穩定。

2.5色譜柱選擇

影響色譜柱組分分離效果的一個重要因素是固定相類型，目標化合物的化學結構和極性是本文主要考慮的因素，以大蒜素和香芹酚為主要原料的混合型飼料添加劑是以大蒜素中的二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚和吐溫80、聚二醇400等助溶劑經過加工混合而成的。因此選擇色譜柱除了要考慮二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的分子結構外。還考慮減少基質的干擾等因素。本實驗采用了3種不同極性的色譜柱，HP-5、HP-50及HP-88毛細管色譜柱，綜合考慮靈敏度，峰形，分析時間，基線漂移等色譜分析因素。HP-5毛細管色譜柱效果最好，因此以HP-5毛細管色譜柱作為本試驗用色譜柱。

2.6柱溫和柱流量的優化選擇

在確定優選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。由于二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚之間的沸點差異較大，同時考慮溶劑聚焦等因素。本研究反復實驗比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數為：進樣口溫度：250℃；色譜柱升溫程序：60℃保留2min，10℃/min升至200℃。保留5min。氣體流量：柱流量，1.85mL/min；氫氣40mL/min：空氣400mL/min；尾吹氣，30mL/min；

2.7提取溶劑的選擇

本研究實驗采用了甲醇、乙醇、丙酮作為樣品的提取溶劑，實驗表明這3種溶劑均能很好地提取目標化合物，由于乙醇較其他溶劑毒性小，價格便宜。易于購買，所以本研究實驗選擇無水乙醇作為提取溶劑。

3 GC/M確證

在空白基質中添加濃度為50mg/kg水平的混標，按1.3.2進行前處理

質譜條件：載氣為高純氦氣。流速為2.0ml/min；采用分流進樣。分流比為20：1：進樣口溫度為250℃，初始溫度為60℃。以10℃/min升至200℃保持5min，離子源為EI源；電子能量為70eV；傳輸線溫度270℃：離子源溫度230℃：四級桿溫度150℃；溶劑延遲3min。采用Scan掃描模式，m/z質量掃描的范圍為50～500m/z。總離子流圖和質譜圖見圖4和圖5

4實際樣品測定

對企業生產的大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑進行測定，準確稱取樣品對企業生產的大蒜素和香芹酚混合型飼料添加劑進行測定，準確稱取樣品1克（精確至0.0001g），樣品加入無水乙醇溶解定容50mL，搖勻靜置。采用GC-FID測定，色譜譜圖見圖7，測定結果與產品明示值相符。

5.結論

本研究建立的氣相色譜法測定混合型飼料添加劑中二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚、香芹酚的方法，能夠實現簡單的樣品前處理和強特異性的優點，并且具有較寬的線性范圍，具有十分顯著的線性關系，加標回收率高，重現性好；使用儀器設備普及率高，可在混合型飼料添加劑中大蒜素和香芹酚的質量檢測及標準制定中加以推廣應用。endprint