異基因造血干細胞移植后急性移植物抗宿主病預防方法研究進展?

王 方 綜述,鄧建川 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院血液科，重慶 400010)

異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是將健康供體的多功能造血干細胞移植到受體，是目前最有希望治愈血液系統惡性腫瘤及部分良性疾病的方法[1]。allo-HSCT主要的臨床優勢是供體T細胞在移植受體內能夠發揮抗殘留病灶的抗腫瘤效應。然而，供體T細胞介導的免疫失調會導致移植受體發生移植物抗宿主病(GVHD)，即使供體和受體的人類白細胞抗原(HLA)完全匹配，供體T細胞對移植受體仍然有很大的毒性作用。這些供體T細胞可以攻擊受體的多個器官和組織，導致較高的發病率和病死率[2]。急性移植物抗宿主病(aGVHD)是allo-HSCT主要臨床并發癥，是一種主要引起紅斑性皮疹、胃腸道癥狀、淤膽型肝炎的炎性疾病。

aGVHD的發生有5個階段[3]：第1階段涉及移植前預處理方案[化療和(或)放療]導致的組織損傷。預處理方案導致炎性介質釋放，這些炎性介質包括腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素-1(IL-1)、黏附分子和促進增強主要組織相容性復合體(MHC)蛋白表達的危險信號，這些促炎性因子促進抗原遞呈細胞(APCs)的活化成熟，以及共刺激分子和細胞因子的表達，從而促進供體T細胞的快速擴增。第2階段涉及供體T細胞的活化。T細胞受體(TCR)和共刺激分子CD28分別與宿主APCs表面表達的相應配體相互識別和相互作用后導致T細胞活化。第3階段，同種異體反應性T細胞擴增和分化成幼稚T細胞、效應T細胞、記憶T細胞、調節T細胞和細胞毒性T細胞(包括Th-1/Tc-1、Th2/Tc2、Th17)和其他亞群。第4階段，趨化因子和黏附分子使活化的T細胞向GVHD靶組織(例如皮膚、消化道、肝、肺)轉運，損傷的組織釋放趨化因子進一步趨化其他效應白細胞(包括中性粒細胞、自然殺傷細胞、單核細胞)到GVHD靶器官中，導致GVHD的發生、發展。第5階段，效應T細胞產生毒性細胞因子和其他免疫效應因子在受浸潤受體組織中誘導細胞死亡。例如CD4+和CD8+的細胞毒性T細胞是GVHD的主要效應細胞，可以通過多種途徑引起組織損傷。最近有研究表明中性粒細胞也是GVHD的影響因素，中性粒細胞通過裂解趨化因子和產生活性氧族來促進T細胞活化[4]。因此，中性粒細胞能增強預處理方案引起的組織損傷。人類腸道相關GVHD的嚴重程度與腸道浸潤的中性粒細胞水平有關[5]。GVHD的嚴重程度與靶器官浸潤的白細胞數量有關，主要是T細胞(CD4+)和中性粒細胞[6]。

過去幾年關于預防aGVHD的方法在不斷發展，本文將對近幾年出現的有效預防aGVHD的方法作一介紹，以提高認識。

1 目前預防aGVHD的方法

1.1標準方法 抗代謝藥(甲氨蝶呤)和鈣調磷酸酶抑制劑(環孢素A或他克莫司)都能抑制異基因活化的T細胞。從20世紀80年代以來，對于接受親緣間或無關供體的清髓性allo-HSCT的受體，甲氨蝶呤與鈣調磷酸酶抑制劑聯合使用一直作為預防GVHD的標準方法[7]。霉酚酸酯(MMF)的代謝產物霉酚酸可以抑制鳥嘌呤核苷酸的合成，從而抑制淋巴細胞的增殖，與鈣調磷酸酶抑制劑在預防aGVHD方面具有協同作用。目前，在非清髓性的異基因造血干細胞移植中，MMF通常與鈣調磷酸酶抑制劑聯合用于預防GVHD[7]。

2 新穎的預防aGVHD的方法

2.1體內去除T細胞

2.1.1抗胸腺細胞球蛋白(ATG) ATG是用人類胸腺淋巴細胞或Jurkat細胞株免疫馬或兔子而獲得的多克隆IgG抗體，ATG包含有針對T細胞表達抗原(例如CD2、CD3、CD4、CD7、CD8)的抗體，可以通過補體依賴性溶解和細胞相關凋亡等細胞死亡途徑來誘導體內T細胞耗竭，可通過誘導STAT5途徑來誘導調節性T細胞的增殖，其中兔源ATG經常用于預防GVHD。Karolinska大學的研究人員進行了一項回顧性研究，110例入組病例在非清髓性預處理后給予非親緣的外周血造血干細胞移植(PBSC，n=95)或骨髓移植(BM，n=15)，比較ATG總劑量為6 mg/kg(n=66)和8 mg/kg(n=44)的差異，結果顯示高劑量ATG組有較低的無白血病生存率(P=0.04)[8]。比利時血液學會進行的一項研究報道將TLI-ATG方案(ATG總劑量1.5 mg/kg，-11～-7 d)與氟達拉濱聯合2 Gy全身照射的低強度方案相比較，結果顯示兩組的總生存率相似(54%vs. 53%)，TLI-ATG組中/重度慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的發生率顯著降低(18%vs.41%，P=0.02)，但TLI-ATG組4年復發或進展的風險較高(50%vs. 22%，P=0.02)[9]。最近報道了一項關于非血緣allo-HSCT的Ⅲ期隨機研究，其中99例患者為ATG組(0.5 mg/kg，-2 d和2 mg/kg，-1 d和+1 d)和97例為無ATG組，67%的患者接受了清髓性預處理，88%的患者接受親緣間外周造血干細胞移植(PBSC)，結果顯示ATG組Ⅱ～Ⅳ級aGVHD發生率明顯降低(50%vs.65%，P=0.01)且沒有增加復發的風險(11%vs.16%，1年)，然而ATG組有較高的EBV病毒活化發病率(33%vs.3%)[10]。KROEGER等[11]報道了另一項PBSC的Ⅲ期隨機研究，155例患者隨機分為ATG組(n=83，10 mg·kg-1·d-1，-3,-2和-1 d)和無ATG組(n=72)，結果顯示cGVHD的2年累積發病率降低(32%vs.69%，P<0.05)，而其他移植結果(白細胞和血小板植入、感染、aGVHD、非復發死亡率、復發率、總生存率、無進展生存期)兩組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.1.2阿倫單抗 阿倫單抗是一種人源化單克隆抗體，可以識別各種白細胞(包括淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞和一些樹突狀細胞)表面的CD52，與CD52受體結合通過補體結合和抗體依賴的細胞介導的細胞毒性機制導致體內T細胞和B細胞耗竭。阿倫單抗可以降低親緣間或無關供者移植受體的GVHD發生風險，但移植后阿倫單抗在血液中可持續存在1～2個月，這將會導致免疫重建的延遲，從而引發病毒性感染和疾病復發[12]。RESENDE等[13]進行的前瞻性隊列研究(共57例病患)，其中23例移植前接受阿倫單抗(兒童 1 mg/kg、成人 30 mg/d)治療，結果顯示移植后100 d阿倫單抗治療組中只有4例發生了Ⅱ～Ⅳ級aGVHD，而未接受阿倫單抗治療組中移植后100 d Ⅱ～Ⅳ級aGVHD發生率為29%，但是阿倫單抗會增加巨細胞病毒激活的風險且沒有提高生存率。

2.1.3噴他司丁 噴他司丁是一種嘌呤類似物，通過抑制腺苷脫氨酶使脫氧腺苷三磷酸累積產生的細胞毒性作用來誘導體內淋巴細胞耗竭。由于T細胞內腺苷脫氨酶的酶活性大于B細胞，因此噴他司丁主要誘導供者T細胞耗竭且抑制骨髓的風險低。PARMAR等[14]進行的控制劑量研究中，對于接受HLA不匹配相關或無關供體移植的受體采用隨機給予不同劑量的噴他司丁(0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/m2)治療，結果表明接受噴他司丁/他克莫司/甲氨蝶呤治療的患者組中，Ⅱ～Ⅳ級GVHD的發病率明顯低于他克莫司/甲氨蝶呤組，其中接受1.0 mg/m2和1.5 mg/m2劑量的噴他司丁組的GVHD發生率最低。

2.1.4環磷酰胺(Cy) Cy是一種氮芥烷化劑，與DNA發生交叉聯結抑制DNA合成，能夠迅速殺死增殖細胞。在移植后早期給予Cy可以抑制異體反應性供者T細胞克隆，同時保留靜息T細胞和造血干細胞以及調節性T細胞(Treg)。RAIOLA等[15]報道接受清髓性半相合骨髓移植后的患者采用Cy(50 mg/kg，+3、+5 d)聯合環孢素A(1 mg/kg，0～+20 d)或Cy(50 mg/kg，+3、+5 d)聯合嗎替麥考酚酯(15 mg/kg，+1～+28 d)預防GVHD，結果顯示Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的發生率為24%，Ⅲ～Ⅳ級aGVHD的發生率為10%。有研究報道，采用跟上述一致的方案預防GVHD時，HLA不匹配的程度可以不作為選擇家庭半相合供體的標準[16]。

2.1.5細胞自殺基因療法 細胞自殺基因療法是另一種很有前途的方法，能夠調節供者T細胞的功能以增強移植物抗白血病(GVL)效應及促進免疫重建，并防止GVHD[17]。單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)已經廣泛地被作為人類自殺基因，可以催化三磷酸丙苷的產生，從而抑制DNA鏈延伸，對增殖細胞有毒性作用。在輸注供體淋巴細胞前，利用反轉錄病毒將HSV-TK轉移到供者T細胞可以有效控制供者T細胞的異體反應。自殺基因修飾的供者T細胞對于接受移植的受體來說，可以有效地抗白血病、抗病毒并且能促進免疫重建。目前，已經有Ⅲ期臨床試驗來評估單純皰疹病毒療法對高風險急性白血病患者移植后GVHD的預防作用[17]。但HSV-TK有潛在的免疫源性，因此一直在探索可替代的自殺基因策略，如誘導人類半胱天冬酶9轉基因(iC9)。

2.2阻斷信號通路

2.2.1硼替佐米 硼替佐米是一種蛋白酶體抑制劑，通過抑制NF-κB、P44/42絲裂原活化蛋白激酶通路，從而減少T細胞的活化、增殖同時增加異體反應性T細胞的凋亡。此外，硼替佐米可抑制活化T細胞中白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-10的釋放，抑制抗原遞呈細胞(APC)的功能和促進Treg增殖[18]。LI等[19]研究硼替佐米在不同時間點和不同劑量下對小鼠GVHD模型的影響是否有差異，研究結果表明：硼替佐米預防aGVHD的有效性取決于硼替佐米給藥的時間和頻率，在移植后0和+1 d靜脈輸注2個劑量硼替佐米(每劑量1 mg/kg)能夠最大獲益，能夠使IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子的血清水平在移植后+7 d顯著降低，在移植后+3 d和+4 d減少供體T細胞的擴增，以及在移植后+7 d增強CD4+T細胞在脾臟中分化成Th17亞型，在移植后0 d和+1 d靜脈輸注2個劑量硼替佐米顯著提高生存率，減輕aGVHD的臨床癥狀(例如皮膚病變、彎腰駝背、體質量減輕、腹瀉)且不改變免疫重建，將硼替佐米給藥時間延遲到移植后+2 d，GVHD相關的病死率顯著增加。

2.2.2CTLA4-Ig 共刺激分子是異體反應性供者T細胞活化的第二信號，CTLA4-Ig(阿巴西普、貝拉西普)是由CTLA4的胞外結構域和人IgG1的Fc片段組成的重組蛋白。CTLA4-Ig與APC表面的B7結合，使之不能與T細胞表面的CD28相互作用。 KOURA等[20]研究接受無關供體造血干細胞移植(HCT)期間通過體內阻斷CD28:CD80/86共刺激通路來預防aGVHD的有效性，在移植后(-1、+5、+14、+28 d)接受環孢素和甲氨蝶呤以及4個劑量的阿巴西普(每個劑量10 mg/kg)的方案患者組中，只有2/10的患者發生了Ⅱ～Ⅳ級aGVHD,但是7/10的患者感染了巨細胞病毒或EB病毒，和同期未接受阿巴西普組相比，接受阿巴西普組中CD4+T細胞的早期活化和增殖顯著被抑制，主要機制可能是影響效應記憶(TEM)亞群，減少CD4+效應記憶細胞的增殖和活化，所有這些表明阻斷共刺激通路是接受無關供體造血干細胞移植患者aGVHD標準免疫預防的重要輔助手段。其他方法還包括：阻斷CD137、可誘導的共刺激物(ICOS)、PD-1、CD40和CD40配體(CD40-L)通路。但以上方法目前仍只是在實驗室動物模型階段，其安全性和有效性仍需更進一步的大量研究。

2.2.3西羅莫司 西羅莫司(雷帕霉素)與細胞內蛋白FKBP12結合，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路，從而阻斷IL-2介導的信號轉導，導致幼稚T細胞的細胞周期阻滯。此外，西羅莫司可抑制抗原呈遞細胞、胸腺，對移植后Treg亞群有保護作用。一項Ⅱ期隨機研究將西羅莫司聯合他克莫司預防aGVHD的效果與甲氨蝶呤聯合他克莫司相比較，結果顯示移植后100 d西羅莫司/他克莫司組Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的發生率顯著降低(43%vs.89%，P<0.05)，兩組之間的總生存率和患者報告的生活質量沒有明顯差別。移植后第30天和第90天，西羅莫司治療的患者外周血CD4+細胞中Treg比例顯著增加，且Treg功能增強[21]。最近，在接受親緣間造血干細胞移植的患者中進行的Ⅲ期多中心試驗也比較了以上兩種方案，發現兩種方案無Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的生存率差異無統計學意義(67%vs.62%，P=0.38)，且Ⅱ～Ⅳ級aGVHD發病率也相似(26%vs.34%，P=0.48)，但西羅莫司/他克莫司組的中性粒細胞和血小板植入時間更短(14 dvs. 16 d，P<0.05，16 dvs. 19 d，P=0.03)，且具有更少的黏膜毒性的優點，但西羅莫司/他克莫司組的內皮損傷綜合征有所增加，特別是預處理中包含有白消安方案的患者[22]。

2.2.4抑制相關信號通路 TLR9和STAT3信號通路對APC的成熟和T細胞的活化至關重要。SAT05f和nifuroxazide為以上兩個關鍵信號通路的抑制劑。研究表明，聯合SAT05f和nifuroxazide治療顯著降低aGVHD的嚴重程度且延長生存率，此外SAT05f和nifuroxazide聯合治療將減少CD4細胞的活化，增加Treg細胞數量，抑制細胞因子的釋放[23]。

2.3Treg Treg是免疫反應的關鍵調節因子，胸腺細胞衍生的Treg表達FoxP3轉錄因子，CD4+CD25+Treg是自身免疫耐受的重要調節因子，在機體對異型抗原產生免疫耐受中至關重要。Treg可減少移植排斥反應，降低GVHD的發生率和嚴重程度。Treg能夠抑制異體反應性供者T細胞的早期擴增，在限制GVHD的發生、發展的同時保持GVL效應。 BRUNSTEIN等[24]設計的研究用于評估在體外用KT64/86(CD28的天然配體)刺激臍帶血擴增衍生的Treg安全性和最大耐受劑量，計劃的劑量水平分別是3、10、30、100、300×109/kg，結果顯示接受3×109/kg劑量患者的Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的發生率與對照組(西羅莫司/MMF)相比顯著降低(43%vs.61%)，在所有患者中aGVHD的100 d累積發生率為9%，而對照組為45%，接受Treg治療組雖然與對照組有相似的感染率，但具有更快的CD4和幼稚CD4+T細胞復原。

2.4調節表觀遺傳學 組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑能改變基因轉錄和表達，以及減少炎癥因子的產生。伏立諾他是一種組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，在非細胞毒性低濃度的情況下，可以通過誘導吲哚胺2,3-雙加氧酶調節APC以及Treg功能，保留GVL效應。CHOI等[25]評估了非清髓性方案中接受相關供體的造血干細胞移植的受體使用伏立諾他預防GVHD的效果，給予方案為他克莫司(0.03 mg·kg-1·d-1，直至8～12 ng/mL的目標水平，-3～180 d)聯合霉酚酸酯(1 g，3次/天，0～28 d)以及伏立諾他(100 mg或200 mg，2次/天，-10～100 d)，結果顯示100 d Ⅱ～Ⅳ級aGVHD的發生率為22%。

2.5阻斷JAK1/JAK2 IFNγR在活化的T細胞中表達，對T細胞轉運到GVHD靶器官至關重要，接受IFNγR-/-供者T細胞的受體中GVHD的發生顯著減少同時保留GVL效應[26]。IFNγR信號是由JAK1和JAK2介導的，阻斷JAK1/JAK2可減少GVHD發生且同時保留移植物抗白血病效應。蘆可替尼 (INCB018424)是市售的強效JAK1/JAK2抑制劑。有研究表明，INCB018424降低兩種(淋巴白血病和髓系白血病)小鼠模型allo-HSCT后GVHD發病率同時保留了移植物抗白血病效應，此外allo-HSCT后長期服用蘆可替尼提高了生存率且優于其他JAK1/JAK2抑制劑，如TG101348或AZD1480。國外有研究報道臨床用蘆可替尼作為激素難治性急性或慢性GVHD的補充性治療，今后能否用于預防，值得探索。

2.6抑制趨化因子和細胞因子受體 達利珠單抗是一種人源化的IgG1單克隆抗體，巴利昔單抗是一種嵌合單克隆抗體。兩者結合IL-2受體的α亞基或CD25來選擇性抑制T細胞活化。最近的一項回顧性分析表明，接受無關供體移植的患者接受巴利昔單抗或達利珠單抗聯合標準的GVHD預防方案可以減少aGVHD發生率且增加2年生存率。

3 小 結

首先，最近20年出現了許多預防aGVHD的方法來改善allo-HSCT后患者的預后，耗竭供體T細胞的策略被證明能夠有效預防aGVHD，此后耗竭T細胞的策略方法不斷涌現，甚至有專門針對活化的同種反應性T細胞。但目前大多數策略在減緩GVHD的同時也減少了可以對抗患者體內殘留病灶的抗腫瘤效應。尋求可以防止GVHD發生、發展又可以保持甚至增加移植物抗腫瘤效應的更安全的方法，能夠對高風險移植患者有極大的幫助。因此，在耗竭T細胞的異基因移植后提高免疫重建和移植物抗腫瘤效應將是未來GVHD預防方法的基本模式。其次，目前一些有希望預防aGVHD的策略(例如JAKs抑制劑)也只是處于實驗室階段，還沒有Ⅱ期的研究評估其安全性和有效性。因此能否真正應用于臨床，還需要進一步的大量研究。此外，Treg預防aGVHD的方法也面臨著挑戰，例如Treg的數量以及保證注入細胞在宿主體內保持免疫調節性。最后，未來對aGVHD的發病機制的新認識可能是促進預防aGVHD的新方法的誕生。從與aGVHD的病理生理有關的細胞因子、細胞內信號通路、表觀遺傳學和免疫調節等方面著手，將是一個預防aGVHD而又不影響移植物抗腫瘤效應的好方法。