中性粒細胞胞外誘捕網與糖尿病足潰瘍的研究進展

何秀娟，林 燕，李 萍

(首都醫科大學附屬北京中醫醫院 北京市中醫研究所，北京 100010)

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)遷延難愈，造成極高的致殘和致死率。中性粒細胞是機體固有免疫的第一道防線，通過吞噬、脫顆粒、分泌細胞因子和形成中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)發揮防御作用。中性粒細胞活化后形成NETs發揮捕獲和消滅病原體作用，這是固有免疫的重要發現。NETs是把雙刃劍，參與多種疾病的病理生理過程。新近研究表明，糖尿病激活了中性粒細胞生成NETs，過多或持續存在的NETs導致糖尿病足潰瘍創面愈合遲緩[1- 2]。

1 中性粒細胞胞外誘捕網的特征

NETs作為一種不同于細胞凋亡和壞死的死亡方式在1996年被Takei等發現[3]，其形成過程在2004年被命名為NETosis[4]。NETs是中性粒細胞受到刺激活化后釋放到胞外的一種DNA網狀結構，其間鑲嵌有組蛋白、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、組織蛋白酶G、鈣網蛋白、蛋白酶3、乳鐵蛋白、正五聚蛋白3、明膠酶、LL37和肽聚糖結合蛋白等具有殺菌和增加通透性作用的蛋白[5]，這些蛋白鑲嵌在DNA骨架上大大增加了其局部濃度[4]。因此NETs的形成被認為是固有免疫的重要事件。目前發現NETosis有3種形式：1)伴隨著中性粒細胞死亡的NETosis，被稱為自殺性NETosis(suicidal NETosis)，持續2～4 h，也是目前報道最多的模型，但是分子過程并未完全明確[6]；2)核DNA釋放的重要NETosis，中性粒細胞形成NETs不破壞核膜和質膜，

時間在5～60 min，并且其不依賴于活性氧(reactive oxygen species, ROS)和Raf/MERK/ERK途徑[7]；3)線粒體DNA釋放的重要NETosis，GM-CSF和脂多糖刺激后形成并依賴ROS[8]。參與創面修復的NETosis主要是自殺性NETosis[9]，多由PMA誘導，當核膜與胞質顆粒膜融合，NE降解染色質內起連接作用的組蛋白H1，肽酰基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)催化核心組蛋白H3或H4的精氨酸進行瓜氨酸化，使染色質解聚，形成DNA 和抗菌蛋白混合物，并隨著胞膜破裂，排至細胞外形成網絡樣結構，此時中性粒細胞死亡[10]。

NETs的形成依賴ROS和NADPH氧化酶[11]。ROS是NE進入細胞核的先決條件。使用蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)激活劑(PMA或H2O2)刺激人髓樣白血病細胞系PLB- 985后可生成NETs，而刺激缺乏NADPH氧化酶2(NOX2)的X-連鎖慢性肉芽腫髓樣白血病細胞系PLB- 985(X-CGD PLB- 985)后無NETs生成，但加入H2O2可促其生成少量NETs[12]。Raf-MEK-ERK通路是NADPH氧化酶的上游通路[13]，二酰甘油可以激活PKC，其類似物可以誘導產生NETs，而其類似物又可以被PKC和c-Raf、MEK和ERK的抑制劑所抑制，阻礙活性氧的生成。Raf-MEK-ERK通路可上調抗凋亡蛋白Mcl- 1來抑制中性粒細胞的凋亡而使其發生NETosis。RIPK1-RIPK3-MLKL信號通路在PMA誘導NETs生成ROS的下游發揮作用[14]。使用RIPK1和MLKL抑制劑(NEC- 1和NSA)處理PMA刺激的人中性粒細胞后都未見核膜和質膜破裂，熒光顯微鏡下發現Nec- 1處理的細胞形成NETs和釋放DNA數量減少。同時PMA刺激人中性粒細胞后RIPK3表達和MLKL磷酸化增加。與野生型小鼠相比，RIPK3基因敲除小鼠的中性粒細胞經PMA刺激后NETs數量至少減少50%。但是也有相反的觀點認為NETs形成不需要RIPK3-MLKL信號通路參與[15]，兩者使用的實驗方法類似，但是PMA刺激時間不同，由此說明NETs的研究目前還沒有標準化的實驗方法和數據分析方法，建立NETs研究的金標準是目前需要解決的問題。

2 中性粒細胞胞外誘捕網與糖尿病

在糖尿病或高血糖狀態下，中性粒細胞發生氧化應激并產生白細胞介素6(IL- 6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細胞因子，傾向于產生NETs。Ⅱ型糖尿病患者血漿中NETs組分(NE、單-寡核小體和 dsDNA)明顯升高，此外，單-寡核小體與糖化血紅蛋白(HbA1c)水平呈正相關，血清中IL- 6濃度和dsDNA呈正相關。因此有人提出假說，NETosis失調和高血糖，氧化應激，炎性反應和糖尿病并發癥密切相關[16]。此外，如果把非糖尿患者的中性粒細胞放在高葡萄糖(25 mmol/L)條件下培養，和低糖組(5 mmol/L)及甘露糖(25 mmol/L)組相比，更易于產生NETosis。由于無能量的糖不影響NETosis，這個現象可以用糖酵解導致活性氧生成增多來解釋。所以NETs在高糖條件生成增多不依賴于糖尿病的類型和來源[7]。

3 中性粒細胞胞外誘捕網與糖尿病足潰瘍

糖尿病激活了中性粒細胞發生自殺性NETosis，NETs過多或持續存在導致創面愈合遲緩。NETosis延緩了DFU的創面愈合。DFU患者血液中NETs組分(NE、組蛋白、NGAL及蛋白酶3)和傷口的NE水平明顯升高，血清和傷口的NE水平都與感染相關并能預測傷口愈合是否遲緩。DFU患者血液中中性粒細胞發生自發性NETosis增多。糖尿病小鼠創面局部PAD4活性升高，組蛋白瓜氨酸化，活體鏡檢也發現其切除性傷口床發生NETosis。糖尿病小鼠與正常小鼠相比，其創面瓜氨酸化的H3升高(H3Cit, NET標志之一)，并且創面愈合延遲。因此，Ⅰ型和Ⅱ型糖尿患者及小鼠的中性粒細胞都被激活并產生NETs，PAD4水平升高，從而導致創面愈合遲緩[2]。

NETosis在體內受到雙機制的調控，包括脫氧核糖核酸酶1(DNase1) 的消化和巨噬細胞的吞噬作用。巨噬細胞呈表型依賴和時間依賴調控NETosis。巨噬細胞可以吞噬發生NETosis 的中性粒細胞，尤其是M2型巨噬細胞。體外把巨噬細胞和發生NETosis 的中性粒細胞共培養發現，NETs降解后巨噬細胞呈表型依賴性應答，M2型巨噬細胞可分泌MIF，CCL2/MCP- 1，CCL3/MIP- 1a和CCL4/MIP- 1b等促炎因子誘導炎性反應，M1型巨噬細胞在PAD4的作用下釋放DNA到細胞外，導致細胞外的DNA增多，這些DNA在半胱天冬酶激活的脫氧核糖核酸酶(caspase-activated DNase，CAD)的作用下被降解并在24 h內被清除。從NETS是把雙刃劍的角度看，細胞外DNA 的暫時升高和隨后的被清除機制非常合理[17]。最新研究發現糖尿病db/db小鼠創面巨噬細胞由M1型到M2型轉化障礙是其愈合遲緩的主要原因之一[18]。糖尿病創面M1型巨噬細胞持續存在導致細胞外的DNA持續增多，如不能及時被清除，會加重組織損傷；M2型細胞減少導致其吞噬發生NETosis 的中性粒細胞能力下降，都導致創面愈合遲緩。

NETs是把雙刃劍，除捕殺病原體外也損傷自身組織和細胞。NETs的細胞毒性與組蛋白、NE和MPO密切相關，應用這些蛋白的抑制劑后NETs的細胞毒性明顯降低[19]。高濃度的NE降解創面的基質導致愈合遲緩，NETs和組蛋白可直接導致上皮細胞和內皮細胞損傷[20]。這樣的毒性環境造成野生型小鼠創面角質細胞增生緩慢。因為正常皮膚不表達PAD4，所以PAD4的異常表達很大程度由于其來源于浸潤的中性粒細胞。對于創面修復，使用NETosis來防御微生物可能并不非常有效，比如糖尿病創面經常感染的葡萄球菌屬，可通過產生DNase破壞NETs的DNA 骨架來逃避捕殺。

4 藥物干預NETs形成和降解治療糖尿病足潰瘍

抑制NETosis或破壞NETs可減輕NETs引起的慢性炎性反應從而促進糖尿病性創面愈合。野生型小鼠切除性皮膚創面產生大量的NETs，而PADi4-/-小鼠(小鼠的PAD4由PADi4基因編碼)卻沒有產生NETs。和野生型小鼠相比，PADi4-/-小鼠創面愈合加快，并不受糖尿病影響。使用PAD4 抑制劑處理可減少小鼠創面結網的中性粒細胞促進傷口愈合[1]。用DNase作用于NETs后，可導致NETs解體并失去抗菌作用。用DNase1處理可促進糖尿病和正常血糖小鼠創面愈合[1]。抑制PAD4來抑制NETs形成或者通過DNase1降解NETs可能成為創面愈合新的治療靶點。

5 展望

NETs是中性粒細胞功能的重大發現，近十年來，人們對通過NETs 研究發現新的治療靶點給予了厚望。糖尿病患者的中性粒細胞、炎性反應和組織損傷的相關性已得到初步證實，NETosis和糖代謝的機制還需要深入研究。目前NETosis標志或NETs檢測方法的金標準還沒有建立，不同實驗室發表的實驗結果也不完全一致[21]。這些為今后深入研究NETs與糖尿病足潰瘍帶來了一定難度，但是可以肯定通過調控NETs為糖尿病足潰瘍的治療展現了新的前景和曙光。

參考文獻:

[1] Wong SL, Demers M, Martinod K,etal. Diabetes primes neutrophils to undergo NETosis, which impairs wound healing[J]. Nat Med, 2015,21:815- 819.

[2] Fadini GP, Menegazzo L, Rigato M,etal. NETosis delays diabetic wound healing in mice and humans[J]. Diabetes, 2016,65:1061- 1071.

[3] Takei H, Araki A, Watanabe H,etal. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis[J]. J Leukoc Biol, 1996,59:229- 240.

[4] Brinkmann V, Reichard U, Goosmann C,etal. Neutro-phil extracellular traps kill bacteria[J]. Science, 2004,303:1532- 1535.

[5] 金梅, 季銀芬, 徐鍵. 中性粒細胞胞外網絡(NET):中性粒細胞殺傷性武器[J]. 現代免疫學, 2014,34:165- 168.

[6] Mohanty T, Sjogren J, Kahn F,etal. A novel mechanism for NETosis provides antimicrobial defense at the oral mucosa[J]. Blood, 2015,126:2128- 2137.

[7] Delgado-Rizo V, Martinez-Guzman MA, Iniguez-Gutierrez L,etal. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: an overview[J]. Front Immunol, 2017,81. doi:10.3389/fimmu.2017.00081.

[8] Yousefi S, Mihalache C, Kozlowski E,etal. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps[J]. Cell Death Differ, 2009,16:1438- 1444.

[9] Masuda S, Nakazawa D, Shida H,etal. NETosis markers: quest for specific, objective, and quantitative markers[J]. Clin Chim Acta, 2016,459:89- 93.

[10] Brinkmann V, Zychlinsky A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin?[J]. J Cell Biol, 2012,198:773- 783.

[11] Naccache PH, Fernandes MJ. Challenges in the characterization of neutrophil extracellular traps: The truth is in the details[J]. Eur J Immunol, 2016,46:52- 55.

[12] Marin-Esteban V, Turbica I, Dufour G,etal. Afa/Dr diffusely adhering Escherichia coli strain C1845 induces neutrophil extracellular traps that kill bacteria and damage human enterocyte-like cells[J]. Infect Immun, 2012,80:1891- 1899.

[13] Hakkim A, Fuchs TA, Martinez NE,etal. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation[J]. Nat Chem Biol, 2011,7:75- 77.

[14] Desai J, Kumar SV, Mulay SR,etal. PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling[J]. Eur J Immunol, 2016,46:223- 229.

[15] Amini P, Stojkov D, Wang X,etal. NET formation can occur independently of RIPK3 and MLKL signaling[J]. Eur J Immunol, 2016,46:178- 184.

[16] Menegazzo L, Ciciliot S, Poncina N,etal. NETosis is induced by high glucose and associated with type 2 diabetes[J]. Acta Diabetol, 2015,52:497- 503.

[17] Nakazawa D, Shida H, Kusunoki Y,etal. The responses of macrophages in interaction with neutrophils that undergo NETosis[J]. J Autoimmun, 2016,67:19- 28.

[18] Mirza R, Koh TJ. Dysregulation of monocyte/macrophage phenotype in wounds of diabetic mice[J]. Cytokine, 2011,56:256- 264.

[19] 倪睿, 魏豐賢, 丁界先, 等. 中性粒細胞胞外誘捕網(NETs)的研究現狀[J]. 免疫學雜志, 2016,32:356- 359.

[20] Saffarzadeh M, Juenemann C, Queisser MA,etal. Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones[J]. PLoS One, 2012,7:e32366. doi:10.1371/journal.pone.0032366.

[21] Masuda S, Nakazawa D, Shida H,etal. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers[J]. Clin Chim Acta, 2016,459:89- 93.

新聞點擊

高蛋白飲食無法抵擋糖尿病

據美國WebMD醫學新聞網(2016- 10- 15)報道，雖然許多人相信高蛋白飲食有助于減重，但一項新研究發現，實際上它可能阻礙了減重所帶來的重要健康益處。

研究發現，當用高蛋白飲食減重時，胰島素敏感性并沒有改善。胰島素敏感性是可以降低糖尿病與心臟病風險的因子。

2型糖尿病患者的細胞會逐漸喪失胰島素敏感性，胰島素敏感性是對代謝激素的反應能力，通常都是伴隨著肥胖產生這種情形，所以改善胰島素敏感性是減重的副產物之一。

然而，研究調查人員Bettina Mittendorfer發現，吃高蛋白飲食減重的女性其胰島素敏感性沒有改善；節食但吃標準量蛋白質的女性其胰島素敏感性改善了25%～30%。

Mittendorfer解釋，這些發現很重要，因為許多過重或肥胖者的胰島素無法有效控制血糖值，最終導致糖尿病。

研究人員也發現，在節食時攝取大量蛋白質對于保持肌肉沒有多大的益處。

有專家認為，身體是需要蛋白質的，但如果攝取的蛋白質超過身體所需，而且有腎臟問題的話，則可能會有害。這些蛋白質可能轉為脂肪貯存，熱量增加，造成體質量也增加。

該研究結果刊登在2016- 10- 11《細胞報告》。