環狀RNA與心血管疾病

李少川，李菊香

(南昌大學第二附屬醫院 心血管內科， 江西 南昌 330006)

1 環形RNA(circular RNA,circRNA)概述

CircRNA首次在RNA病毒中被發現[1]，隨后在酵母菌和真核生物中也證實其存在，小鼠的性別決定區SRY中也發現了circRNA。隨著測序技術的發展，尤其是RNA-seq技術的開發[2]，circRNA的研究在幾年得到快速發展。circRNA的主要特征是環狀結構，外顯子的3′端轉回并連接其上游外顯子的5′端以形成閉合分子。與經典的線性RNA不同，circRNA不存在5′帽和3′多聚腺苷酸尾。由于不存在游離末端，所以這些分子不容易水解，特殊的環形結構使circRNA具有一定的保守性和穩定性[3]。對脫支酶和RNA外切核酸酶具有較高的抵抗，也因為一些外顯子環RNA的基因產物水平高于線性RNA， 所以circRNA可以作為生物標志物來診斷疾病，也可以作為預后評估的一個指標，還可以在治療的關鍵靶點等方面具有明顯的優勢。由于circRNA分子富含miRNA結合位點，可以特異性地結合miRNA并抑制其功能，這一機制稱為競爭內源RNA(ceRNA)機制，類似海綿吸收miRNA，稱之為miRNA海綿體作用(miRNA sponge)。許多疾病與circRNA相關，如腫瘤、神經系統、心血管和自身免疫性等疾病都被證明與circRNA密切相關。circRNA通過與疾病關聯的miRNA作用在分子水平對疾病進行調節，提示circRNA可以成為一種新的基因表達調節劑。

1.1 circRNA與心肌肥厚

目前有多種機制解釋心肌肥大如何進展成心力衰竭，如通過鈣調神經磷酸/NFAT途徑和血管緊張素系統等發揮作用，但尚無一個公認的機制詮釋心力衰竭的發生和發展。有報道指出從circRNA數據庫中隨機篩選了100個circRNA，其中 36個circRNA在心臟高度表達，稱為心臟相關的circRNA(HRCR)。并發現HRCR可以通過與miRNA結合發揮其生物學功能[4]。miR- 223通過抑制其下游靶點ARC(具有CARD結構域的凋亡阻抑物，ARC的3′UTR是miR- 223的結合位點)，使其表達降低。miR- 223使ARC在心肌細胞中表達降低，可以增強異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌肥厚作用。HRCR可以作為miR- 223海綿狀物結合并抑制miR- 223的活性，因此認為 HRCR是抗增殖因子，抑制心肌的肥大，初步的結果證明circRNA在心肌肥大誘發的心力衰竭中起關鍵作用。雖然證明miR223可以由 HRCR調節，但是不排除其他circRNA或其他基因及表達產物可直接或間接地調節miR- 223。在ISO心力衰竭模型中的其他HRCR非依賴性途徑和它們在調節miR- 223中的作用尚需進一步確定， miR- 223的下游靶點需更深入的研究。

1.2 circRNA與心肌細胞衰老

心肌細胞衰老是身體功能的逐漸惡化和死亡的主要原因，可發生在細胞水平或生物水平。細胞衰老，也稱為復制衰老，其特征在于二倍體細胞的有絲分裂停止，而生物水平衰老的特征在于應激反應降低和穩態平衡被打破，導致生物體的正常功能喪失。在生物應激中，常用化學藥物多柔比星(Dox)來產生氧化應激以誘導細胞凋亡，制作心肌功能不全模型[5]。circRNA Foxo3的異位表達促進Dox誘導心肌病形成，但沉默內源性circRNA Foxo3可以減緩Dox的作用并阻止心肌病的形成。細胞質中異位表達的circRNA Foxo3結合抗衰老相關蛋白ID1和E2F1、抗應激相關蛋白HIF1α和FAK(HIF1α和FAK均可以抑制衰老)。細胞質中Foxo3的增加導致細胞質中ID1、E2F1、HIF1α和FAK的含量減少。這些蛋白質的抗衰老功能被阻斷，其結果是，circRNA Foxo3的異位表達促進細胞衰老，而沉默circRNA-Foxo3減少細胞衰老和凋亡。有報道靈芝可以抑制CIRC-Foxo3并且提高左室射血分數,改善心輸出量，改善心肌衰老[6]。

1.3 circRNA與心肌細胞纖維化

心肌纖維化受多種因素調節，其中基因水平的影響不容忽視。有報道在小鼠心肌纖維化模型中circRNA的表達譜和潛在機制[7]。使用circRNA微陣列檢查糖尿病小鼠心肌的circRNA發現43個circRNA異常表達，包括24個上調和19個下調。在血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)處理的糖尿病小鼠心肌中的心臟成纖維細胞(CFs)中，circRNA_010567顯著上調。生物信息學分析預測circRNA_010567可以作為miR- 141的海綿體，而且miR- 141可以直接靶向TGF-β1并抑制其表達(雙熒光素酶測定驗證)。隨后實驗顯示circRNA_010567沉默可上調miR- 141并下調TGF-β1(纖維化的必需分子)表達。同時可以抑制Col Ⅰ、Col Ⅲ和α-SMA等成纖維細胞的表達。circRNA_010567 / miR- 141 / TGF-β1在糖尿病小鼠心肌纖維化模型中起著重要的調節作用。同時有類似研究發現circRNA_000203可以通過消除miR- 26b- 5p與Col1a2和CTGF的靶標相互作用來抑制miR- 26b的抗纖維作用[8]。這個過程也是利用了circRNA的miRNA的海綿作用與miR- 26b- 5p緊密結合。circRNA_000203特異性增強Col1a2、Col3a1和α-SMA等成纖維細胞的表達，miR- 26b就是通過抑制Col1a2、Col3a1、α-SMA和CTGF在內的纖維化相關基因的表達而起到抗纖維化的作用。所以circRNA_000203的表達增多會引起心肌纖維化。circRNA_010567和circRNA_000203分別作為miR- 141和miR- 26b- 5p的海綿體起到抑制miRNA的作用。上述研究發現心肌纖維化的過程中兩類RNA相互作用至關重要。miRNA可以抑制纖維化，而circRNA可以抵消miRNA的抗纖維化作用，從基因水平闡述了心肌纖維化的調控作用。

1.4 circANRIL動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種全身性疾病，是由于脂肪沉積物、炎性反應、細胞和瘢痕組織在動脈壁內積累而導致的疾病。 有報道circ ANRIL參與AS發生[9]，circANRIL是在染色體9p21的AS基因座上轉錄的INK4基因座。circANRIL中的環狀反義非編碼RNA通過控制核糖體RNA(rRNA)成熟來調節動脈粥樣硬化形成。實驗證實circANRIL結合到rRNA的C端賴氨酸豐富的區域PES1上，占據PES1與pre-rRNA結合位點，阻止核酸外切酶介導的rRNA成熟。circANRIL抑制核糖體形成過程并導致pre-rRNA的積累，導致p53活化和隨后細胞凋亡增加，導致增殖率的降低，通過減少過度增殖的平滑肌細胞使動脈粥樣硬化發生減少。提示circANRIL可以作為治療AS的潛在治療靶標。

1.5 circRNA與冠心病

冠心病(coronary atherosclerotic heart disease， CAD)是心血管疾病中致死率最高的疾病[10]，一直被臨床工作者重視，但早期診斷存在一定的困難。目前診斷的方式有很多種，無創檢查有心電圖(ECG)、心電圖平板運動實驗(TET)、動態心電圖(Holter)監測和冠狀動脈計算機斷層攝影(CTA)，有創冠狀動脈造影(CAG)檢查。但是各自存在弊端，ECG靈敏度以及特異性低，CTA價格昂貴，患者一般難以接受CAG檢查。hsa_circ_0124644在冠狀動脈疾病的患者中明顯上調，靈敏度和特異性分別為0.861和0.626，hsa_circ_0098964敏感性和特異性分別為0.825和0.730[11]。常規ECG的靈敏度和特異性已顯示為0.290和0.670[12]。Holter及TET監測的靈敏度和特異性分別為0.649、0.894[13]和0.731、0.693[14]，CTA的靈敏度和特異性分別為0.920和0.750[15]，CAG一直作為CAD的診斷金標準。綜合價格和患者的依從性等因素，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964可以作為診斷CAD的一種手段。而且circ RNA的特殊環狀結構不易被酶分解，更加證明了其可以作為診斷CAD的一種方法。

1.6 circRNA與心肌梗死

心肌梗死(myocardial infarction,MI)一般發生于冠心病的基礎上，心肌梗死多伴有心肌細胞的凋亡。有報道用左前動脈永久結扎制造大鼠心力衰竭模型發現circRNA Cdr1as和miR- 7a的共表達，且Cdr1as是miR- 7a的海綿體，可以抑制miR- 7a的生物學功能[16]。miR- 7a通過靶向抑制PARP和SP1的表達(PARP和SP1均是可以促進心肌凋亡的蛋白)，從而抑制MI的心肌凋亡。circRNA Cdr1as可以引發MI，其中一條途徑就是通過抑制miR- 7a對PARP和SP1的抑制作用。還發現miR- 7a并不受過表達的Cdr1as所誘導， miR- 7a對正常的心肌細胞凋亡無影響，僅僅對應激誘導的心肌凋亡有影響，并且在應激狀態下才會被Cdr1as所抑制。有報道在冠脈結扎誘導的心肌細胞凋亡大鼠模型中發現mm9-circ 01659 明顯上調，稱之為MFACR(線粒體裂變和凋亡相關的circRNA)，通過海綿體作用下調miR- 652- 3p控制心臟線粒體分裂和細胞凋亡[17]。miR- 652- 3p可以通過抑制MTP18(線粒體蛋白18)的表達來阻斷線粒體裂隙和心肌細胞死亡。MFACR在細胞質中直接螯合miR- 652- 3p并抑制其活性。 實驗證明敲低MFACR的小鼠心肌細胞線粒體裂解的現象減弱,表明circRNA在調節心臟線粒體動力學和凋亡中的關鍵作用。MFACR和circRNA Cdr1as的發現為進一步研究MI的發生以及后續的診斷和治療提供了新的依據。

1.7 circRNA與主動脈瘤

主動脈瘤是指主動脈病理性的擴張，超過正常血管直徑的50%，具有很高的死亡風險，發生機制復雜。有報道發現hsa-circ- 000595與主動脈平滑肌凋亡有關，進而影響主動脈瘤的發生。在低氧條件下主動脈平滑肌細胞中hsa-circ- 000595的表達上調，通過敲低hsa-circ- 000595發現低氧條件下主動脈平滑肌細胞凋亡減弱。實驗還發現hsa-circ- 000595是作為miR- 19a海綿體來起作用的，hsa-circ- 000595減低可以使miR- 19a表達增加，從而減少平滑肌細胞凋亡[18]。miR- 19a影響平滑肌細胞的機制還需要進一步探討，但是hsa-circ- 000595的發現可以為診治主動脈瘤提供一個新的基因學上的依據。

2 小結

隨著基因測序技術的升級，越來越多的基因組數據庫被建立，有許多在線數據庫可以用于circRNA的研究，目前僅有少數circRNA被證明與心血管疾病有關，如HRCR、hsa_circ_0124644和circRNA Cdr1as等，其中大部分circRNA都是作為miRNA的海綿體而發揮作用，提示兩者之間可能存在著某種聯系，但作為與遺傳高度相關的高血壓和心律失常等疾病卻無circRNA的身影，現已發現人類體內含有上萬個circRNA，其中是否有大量和心臟疾病相關的circRNA值得研究。