山東銀蓮花組織培養植株再生體系的建立

陳春利， 顧德政， 劉 毓， 孟清秀， 李可勤

(1.山東農業工程學院，山東濟南 250100； 2.濟南市花卉研究所，山東濟南 250100)

山東銀蓮花[Anemoneshikokiana(Makino) Makino]是毛莨科(Ranunculaceae)銀蓮花屬(Anemone)植物朝鮮銀蓮花(Anemonechosenicola)的變種[1]，屬于多年生草本植物，特產于山東東部，以嶗山、昆崳山為分布中心，常生于海拔500 m以上的山坡草叢及陰濕林下，嶗山之嶗頂及昆崳山之泰礴頂附近草叢中常見其生長[2]。海拔、生境等對其分布具有一定的影響，因此其分布極其狹窄，屬于典型的稀有物種，由于嶗山、昆崳山兩地均為旅游景區，山東銀蓮花的生境破壞嚴重，使得該物種更加稀有[3]。山東銀蓮花為我國的特有種質資源，國外還未見相關研究報道，而國內目前對其報道也很少，最早可見的報道是臧得奎等在1999年對山東特有野生花卉進行的初步研究[2]。2011年，徐曉艷等對山東銀蓮花種子萌發特性進行了研究[4]。2014年，王鷙等對山東銀蓮花的分布格局及影響因子進行了分析[1]，劉瓊從基因分化水平研究山東銀蓮花的遺傳多樣性[5]。關于山東銀蓮花引種馴化、組織培養、藥用價值的研究至今未見報道。為此，實現對山東銀蓮花的應用，需要開展相應的人工栽培研究，而人工栽培的關鍵在于解決山東銀蓮花種苗繁殖問題。本試驗以山東銀蓮花幼嫩莖段為外植體，擬構建穩定的植株再生體系，并探討幾個相關影響因素，以期為山東銀蓮花的快速繁殖、遺傳多樣性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料的獲取

2015年10月于昆崳山泰礴頂，剪取山東銀蓮花帶飽滿頂芽的幼嫩莖段，用瓶裝水沖洗后裝入保溫杯內。

1.2 材料消毒

取山東銀蓮花帶頂芽幼嫩莖段，用毛筆蘸洗衣粉水輕輕刷洗其表面灰塵，然后放入干凈的容器中，在流水下沖洗1～2 h，再用0.5%多菌靈粉劑浸泡15 min，隨后用蒸餾水沖洗 3～10次，最后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分。

外植體滅菌：將處理完的莖段轉移至三角瓶中，在超凈工作臺內先用75%乙醇消毒30 s，之后用無菌水沖洗3次，然后用1% NaClO分別處理10、20、25 min，再用0.1% HgCl2分別處理8、10、13 min，在滅菌過程中滴加1～3滴吐溫并充分搖晃三角瓶，使殺菌劑與外植體充分接觸，最后用無菌水沖洗 6～10次，將長為1～2 cm的莖段接種到含有0.2 mg/L 6-BA 的MS啟動培養基中。每個培養瓶中接種1個外植體，每個處理接種30瓶，重復3次，7 d后觀察外植體的滅菌及生長情況，并統計各處理間的污染率、褐化率、存活率。

1.3 繼代與增殖培養

以MS為基本培養基，分別添加植物生長調節劑6-芐氨基腺嘌呤(即6-BA，濃度設為0.5、1.0、1.5 mg/L)、α-萘乙酸(即NAA，濃度設為0.00、0.05、0.20 mg/L)、赤霉酸(即GA3，濃度設為0.00、0.05、0.20 mg/L)作為愈傷組織的誘導培養基。然后將消毒后的外植體接種于上述培養基上培養，每個處理30株苗，重復3次，30 d后統計增殖系數。

1.4 生根培養與移栽

取株高已達2 cm以上的叢生芽，在無激素的MS培養基中壯苗培養20 d，再接入1/2MS生根培養基中進行培養。生根培養基采用3因素3水平正交試驗設計，各因素分別為NAA(濃度設為0.0、0.5、1.0 mg/L)、吲哚丁酸(即IBA，濃度設為0.0、5.0、10.0 mg/L)、蔗糖(濃度設為25、30、35 g/L)。每個處理30株苗，重復3次。

待組培苗生長至10 cm左右時，開蓋后煉苗1周，然后將完整的再生植株移栽于蛭石、珍珠巖、草炭體積比=1 ∶2 ∶2的基質中(高壓滅菌)，并保持適宜溫度和濕度，隔天澆1次水。

1.5 培養條件

將培養室的溫度恒溫保持在(25±1) ℃，愈傷組織分化和植株再生階段的光照度為50 μmol/(m2·s)，光照時間為16 h/d。

1.6 統計分析方法

試驗數據使用DPS 9.50、SPSS 18.0進行方差分析和顯著性分析，用Excel 2003制表。觀測變量的計算公式如下：

增殖系數=新增殖的芽數/接種芽的總數；

污染率=(污染的外植體數/接種外植體的總數)×100%；

褐化率=(褐化的外植體數/接種外植體的總數)×100%；

存活率=(存活的外植體數/接種外植體的總數)×100%；

生根率=(生根的組培苗數/接種組培苗的總數)×100%；

誘導率=(誘導分化的外植體數/存活外植體的總數)×100%；

移栽成活率=(移栽存活的組培苗數/移栽組培苗的總數)×100%。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌方法的選擇

將經過消毒處理的山東銀蓮花莖段接種到培養基上培養7 d后，統計污染率、褐化率和存活率。由表1可以看出，用1% HgCl2消毒處理的外植體污染率極顯著低于1% NaClO處理，但褐化率極顯著高于1% NaClO處理。1% HgCl2處理10 min的外植體存活率最高，達到35.93%。1% HgCl2各處理間差異整體不顯著，但與1% NaClO處理10、20 min之間差異極顯著。通過上述多重比較，綜合分析不同消毒處理對外植體污染率、褐化率及存活率的影響可知，1% HgCl2處理 10 min 為適合山東銀蓮花莖段外植體的最佳消毒處理方法。

表1 不同消毒處理對山東銀蓮花莖段外植體污染率、褐化率及存活率的影響

2.2 增殖培養

將消毒好的外植體分別接種于添加不同種類和濃度植物生長調節劑的MS培養基上培養，30 d后統計增殖系數。由表2可知：6-BA、NAA、GA33種培養因素對山東銀蓮花組培苗增殖系數的影響程度差異很大，其中6-BA對增殖系數的影響最大，與其他處理間差異明顯。其次是GA3、NAA處理。對6-BA的各個水平間進行多重比較發現，添加0.5、1.0 mg/L 6-BA與添加 1.5 mg/L 6-BA處理間存在極顯著差異，而添加0.5、1.0 mg/L 6-BA水平之間差異不顯著；添加GA3的組培苗與不添加的相比更加纖弱，苗不夠健壯，且有莖尖和葉片枯死現象。由此可見，最佳的增殖培養基為 MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

從試驗觀察結果看，6-BA的濃度與山東銀蓮花的褐化程度密切相關，隨著濃度的增加，褐化程度加劇，當6-BA的濃度達到1.5 mg/L時，更易導致組培苗的褐化，可能是由于6-BA能促進酚類化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。因此綜合分析確定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為山東銀蓮花的最佳增殖培養基，結果顯示，30 d時增殖系數為3.43。山東銀蓮花組培苗的增殖狀況見圖1、圖2。

2.3 生根與移栽

2.3.1 生根培養基的篩選 將經過壯苗培養30 d、株高達 2 cm以上的健壯山東銀蓮花組培苗植株轉接入含有不同濃度植物生長調節劑、蔗糖的培養基及基本培養基中進行生根培養。由表3可以看出：3種因素對山東銀蓮花組培苗生根率的影響程度差異很大，其中IBA對生根率的影響最大，其次是NAA和蔗糖處理，且IBA的各個水平間差異均達到了極顯著水平。因此可以得出，適合山東銀蓮花組培苗的最佳培養基為1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂。

表2 植物生長調節劑對山東銀蓮花組培苗增殖培養的影響

2.3.2 馴化移栽 移栽基質的成分對組培苗的成活有很大影響，與組培苗能否移栽成活直接相關。由表4可知，在處理5培養基(珍珠巖、蛭石、草炭體積比=1 ∶2 ∶2)上生長的組培苗較處理3、處理4 2種基質成活率高，為83.36%，達到極顯著水平，而在處理2培養基(珍珠巖、蛭石、草炭體積比=0 ∶1 ∶1)上生長的組培苗成活率最低。山東銀蓮花組培苗的最佳移栽基質配比為珍珠巖、蛭石、草炭體積比=1 ∶2 ∶2。山東銀蓮花組培苗的生根與移栽狀況見圖3。

表3 植物生長調節劑及蔗糖對山東銀蓮花組培苗生根的影響

表4 不同比例的移栽基質對山東銀蓮花組培苗移栽成活率的影響

3 討論

3.1 外植體的選擇及滅菌

選擇合適的外植體是植物組織培養成功的關鍵因素之一，一般在自然條件下生長勢旺的植物種類更容易建立組培快繁體系，且易分化、增殖；而在自然條件下繁殖較慢的品種進行離體培養的繁殖系數相對較小。山東銀蓮花是典型的山東省稀有植物物種，對生存環境的要求較為苛刻，在自然條件下生長緩慢，抗逆性差，因而較難建立組培快繁體系。此外，山東銀蓮花組織培養中材料的大小選擇也十分重要，材料太大容易污染，材料太小，難以成活。因此，一般選取的材料長度為0.5～1.0 cm左右。

山東銀蓮花的帶頂芽莖段由于直接暴露在土壤和空氣中，且有鱗片包被，其芽體和芽體內部易積累污染物，因此消毒滅菌困難，只有選擇合適的滅菌劑和滅菌方法，才能有效建立起無菌體系，一般植物組織培養中常用的消毒劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、氯化汞等，在本試驗中，HgCl2消毒的整體效果要遠遠好于采用NaClO的消毒效果，但是山東銀蓮花外植體接種后會出現不同程度的褐化，隨著HgCl2濃度的提高，其褐化程度也在不斷加大，因而山東銀蓮花外植體的最佳滅菌方法是用75%乙醇消毒30 s，再用無菌水沖洗3次，然后用0.1% HgCl2處理10 min，最后用無菌水沖洗6次，接種后可獲得較低的污染率和最高的存活率。

3.2 不同植物生長調節劑對組培器官發生的影響

植物生長調節劑對于培養物的生長尤其是形態建成起著極其重要而明顯的作用，植物自身的生長調節物質的種類和濃度調節著細胞分化、伸長的啟動，并調節愈傷組織生長以及根、芽的分化和發育。但是外源激素必須通過植物體內的內源激素水平來起作用，因此，外植體形態發生的誘導和調節是通過多種激素的相互平衡以及協同來共同實現的。

6-BA是目前植物組培研究中常用的一種細胞分裂素，能夠有效誘導植物的分化再生，本研究表明，6-BA對組培苗增殖的影響極顯著，起到了決定性作用，6-BA和NAA配合使用可以獲得較高的增殖系數。試驗觀察結果表明，6-BA 濃度與山東銀蓮花的褐化程度密切相關，隨著濃度增加，褐化程度加劇，當6-BA濃度達到1.5 mg/L時，更易導致組培苗的褐化，原因可能是6-BA能促進酚類化合物的合成或者是刺激多酚氧化酶活性的提高。一些植物在組培中添加GA3可促進莖生長、提高增殖系數，但有時會導致莖尖和葉片枯死，建議間斷使用。本研究添加一定濃度的NAA或GA3均取得了類似的效果。添加GA3的組培苗與不添加的相比更加纖弱，組培苗不夠健壯，且有莖尖和葉片枯死現象。因此，綜合分析確定MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為山東銀蓮花的最佳增殖培養基。

3.3 生根培養

在生根培養過程中，大量的研究表明，起主導作用的是生長素，不同類型的生長素對組培苗的生根誘導差異比較明顯。本試驗中植物激素的添加對山東銀蓮花組培苗生根率的影響程度差異很大，單獨添加IBA、NAA均能誘導山東銀蓮花組培苗不定根的產生，但添加IBA的生根效果明顯好于添加NAA的生根效果，添加NAA誘導出的根多為愈傷根系，而且分化出的根粗大，生長異常，根系脆弱，一碰就斷，移栽時難以成活，組培苗經過IBA誘導出的根系不經過愈傷組織，從組培苗的基部直接發生，而且根系的生長發育狀況好，根系健壯，從而移栽成活率高。因此在本試驗中得出適合山東銀蓮花組培苗的最佳培養基為1/2MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂。

4 結論

本研究以山東銀蓮花幼嫩莖段為外植體，分析了外植體消毒和不同激素配比對增殖、生根培養的影響，成功建立了其組織培養植株再生體系。結果表明，1% HgCl2處理10 min可以降低外植體污染率、褐化率，存活率較高；最佳增殖培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+25 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；最佳生根培養基為1/2 MS+10.0 mg/L IBA+35 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂；最佳組培苗移栽基質配比為珍珠巖、蛭石、草炭體積比為1 ∶2 ∶2。從外植體培養到植株再生共需16周左右。山東銀蓮花組培再生體系的建立為進一步探討其遺傳多樣性奠定了基礎。