盆栽菊花的莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)

李曉亮， 張軍云， 張 鐘， 段永華， 張建康， 王文智， 楊光炤， 錢遵姚， 張翠萍

(玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南玉溪 653100)

菊花[Dendranthemamorifolium(Ramat.)Tzvel.]為菊科多年生宿根草本植物，是我國的傳統(tǒng)名花，也是世界四大切花之一，是一種被廣泛栽培的重要花卉[1-3]。菊花目前主要用于園林的綠化和觀賞，如制作花束、花環(huán)、觀賞盆花、秋季花壇、花臺、盆花群等，深受人們喜愛[3-4]。菊花傳統(tǒng)的繁殖方法主要是扦插和嫁接，但存在很多缺點(diǎn)：需較多母株材料、植株病毒逐代積累加重、品質(zhì)退化、繁殖速度不快、易受季節(jié)變化和外界環(huán)境條件的影響、病蟲害發(fā)生頻率高等[5-8]，為解決這些問題，目前最有效的技術(shù)措施之一是菊花的莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)[2，4-6，9]。

我國的菊花組織培養(yǎng)技術(shù)研究始于20世紀(jì)80年代[10]，截至目前的研究主要集中于菊花的花瓣[11-13]、花蕾[2，14]、葉片[15-16]、莖段[6，17]的組織培養(yǎng)，而有關(guān)菊花莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道較少[7，9，18]，且這些報(bào)道的研究內(nèi)容簡單，僅主要涉及激素與菊花增殖量、生根量的關(guān)系，更是幾乎沒有涉及種苗綜合素質(zhì)。因此，建立完善的菊花莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，對菊花脫毒復(fù)壯、工廠化快繁育苗、種質(zhì)資源保存等，進(jìn)而更好地促進(jìn)菊花的生產(chǎn)發(fā)展，具有重要意義。

為此，以盆栽菊花香草水晶的莖尖為材料，研究HgCl2濃度及其滅菌時間、基礎(chǔ)培養(yǎng)基、6-BA等9種主要因素對菊花莖尖組織培養(yǎng)快繁的影響，分析培養(yǎng)基與種苗綜合素質(zhì)的關(guān)系并據(jù)此篩選出適合的培養(yǎng)基，旨在建立一套完善的且能育出優(yōu)良綜合素質(zhì)種苗的盆栽菊花莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，為菊花脫毒復(fù)壯、工廠化快繁育苗、種質(zhì)資源保存等提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年1—7月在玉溪市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研和基地的組培室實(shí)施。

1.2 試驗(yàn)材料

采用盆栽菊花香草水晶的莖尖作為外植體，于玉溪紫玉花卉產(chǎn)業(yè)有限公司的盆栽菊花母本園里采集帶莖尖長3～5 cm 的菊花莖段。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)基以MS或1/2 MS或1/4 MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，均含瓊脂(強(qiáng)度為1 200 g/cm2)5.2 g/L、白砂糖30 g/L(增殖試驗(yàn)除外)，附加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑。培養(yǎng)基pH值為 5.4～5.6，并用121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。培養(yǎng)室溫度為(25±2) ℃，相對濕度為35%～40%，光照度約為2 500 lx，光照時間為12 h/d。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 外植體的滅菌 剪取莖段的頂芽，用自來水流水沖洗1 min，再用洗潔精的水溶液浸泡2 min，在超凈工作臺上用70%乙醇浸泡30 s后滅菌外植體，設(shè)置8個處理：處理1(0.15% HgCl2滅菌2 min)、處理2(0.15% HgCl2滅菌 3 min)、處理3(0.15% HgCl2滅菌4 min)、處理4(0.15% HgCl2滅菌5 min)、處理5(0.20% HgCl2滅菌2 min)、處理6(0.20% HgCl2滅菌3 min)、處理7(0.20% HgCl2滅菌 4 min)、處理8(0.20% HgCl2滅菌5 min)。每個處理滅菌10個菊花莖尖，重復(fù)3次，滅菌后的莖尖用無菌水浸泡2 min，切取莖尖生長點(diǎn)(約1.0 mm)，接種生長點(diǎn)入MS+6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.8 mg/L+萘乙酸(NAA)0.01 mg/L中(莖尖生長點(diǎn)數(shù)為1個/瓶)培養(yǎng)15 d，記錄莖尖的細(xì)菌污染和存活，統(tǒng)計(jì)莖尖的細(xì)菌污染率和死亡率，計(jì)算公式：細(xì)菌污染率=細(xì)菌污染的莖尖個數(shù)/接種的莖尖總數(shù)×100%；死亡率=死亡的莖尖個數(shù)/接種的莖尖總數(shù)×100%。

1.4.2 初代培養(yǎng) 設(shè)置2種處理的培養(yǎng)基：處理1(MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.01 mg/L)、處理2(MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.01 mg/L)。將滅菌后無污染的莖尖生長點(diǎn)接種于2種培養(yǎng)基中初代培養(yǎng)30 d。

1.4.3 增殖培養(yǎng) 設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)(表1)，每個處理10瓶，每瓶接種5個含雙腋芽的無菌莖段，增殖培養(yǎng)35 d后調(diào)查各處理的植物形態(tài)類型、成株(芽)率、株(叢芽)高、節(jié)間距、莖粗、增殖系數(shù)。調(diào)查方法：當(dāng)接種的莖段分化長成植株或芽時，則認(rèn)為該莖段已成株(芽)，將成株(芽)數(shù)記錄為1；調(diào)查增殖系數(shù)時，若母瓶內(nèi)為芽(叢芽)時，將2個單芽等同于1個雙腋芽的莖段；當(dāng)調(diào)查株(叢芽)高、節(jié)間距、莖粗、增殖系數(shù)時，均分別在各自所有樣本中隨機(jī)取樣調(diào)查10個樣本，若樣本量不足10個，則以實(shí)際樣本調(diào)查；統(tǒng)計(jì)成株(芽)率和增殖系數(shù)，計(jì)算公式：成株(芽)率=[成株(芽)數(shù)/接種莖段數(shù)]×100%；增殖系數(shù)=新莖段(芽)數(shù)/接種莖段數(shù)。

1.4.4 生根培養(yǎng) 采用正交試驗(yàn)+對比試驗(yàn)+附加試驗(yàn)的方法開展菊花生根試驗(yàn)，其中正交試驗(yàn)為L9(34) 設(shè)計(jì)，對比試驗(yàn)為正交試驗(yàn)的每個處理均添加0.1%的活性炭(AC)，附加試驗(yàn)為植物組織培養(yǎng)中一些經(jīng)驗(yàn)性或常用的生根培養(yǎng)基，共24種處理的培養(yǎng)基(表2)，每個處理9瓶，每瓶接種5個無菌莖段，生根培養(yǎng)35 d后調(diào)查各處理的成株率、植株的根發(fā)生部位、生長勢、生根率、株高、莖粗、葉片數(shù)、生根數(shù)、根長、根粗。調(diào)查方法：當(dāng)接種的莖段分化成植株時，則認(rèn)為該莖段已成株，將成株數(shù)記錄為1；當(dāng)調(diào)查株高、莖粗、葉片數(shù)、生根數(shù)、根長、根粗時，均分別在各自所有樣本中隨機(jī)取樣調(diào)查10個樣本，若樣本量不足10個，則以實(shí)際樣本數(shù)調(diào)查為準(zhǔn)；統(tǒng)計(jì)成株率和生根率，計(jì)算公式：成株率=[成株數(shù)/接種莖段數(shù)]×100%；生根率=生根的植株數(shù)/成株數(shù)×100%。

表1 盆栽菊花香草水晶增殖培養(yǎng)正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和SPSS 16.0處理和分析數(shù)據(jù)，用SNK檢驗(yàn)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

處理間的菊花莖尖滅菌效果差異顯著(P<0.05)(表3)。同一HgCl2濃度下，增加滅菌時間，莖尖的細(xì)菌污染率降低，死亡率增加。綜合分析處理間的細(xì)菌污染率和死亡率，菊花莖尖最佳的滅菌方法是0.20% HgCl2滅菌4～5 min，此處理下的莖尖細(xì)菌污染率較低(P<0.05)，死亡率也不算高(<30%)，滅菌非常徹底。

2.2 初代培養(yǎng)

菊花莖尖生長點(diǎn)接種于培養(yǎng)基(圖1-A)上培養(yǎng)，5 d后莖尖的生長點(diǎn)萌動，伸長，基部膨大。培養(yǎng)15 d時，誘導(dǎo)莖尖生長點(diǎn)分化成高約1.0 cm的頂芽，芽體形態(tài)正常(圖1-B)，培養(yǎng)30 d時，分化成高約2.0 cm、含6～8個單芽組成的叢生芽(包括不定芽)，單芽的芽體形態(tài)結(jié)構(gòu)良好、健壯、無玻璃化、無黃化(圖1-C)。

菊花莖尖在2種初代培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果無明顯差異，均表現(xiàn)為芽體的形態(tài)結(jié)構(gòu)良好、生長勢健壯(圖1)。因此，菊花莖尖的適宜初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4～0.8 mg/L+NAA 0.01 mg/L。

2.3 增殖繼代培養(yǎng)

菊花莖段接種(圖2-A)培養(yǎng)后，處理間菊花莖段的發(fā)育和增殖分化差異明顯，出現(xiàn)了3種植物形態(tài)類型：叢生芽(圖2-B～圖2C)、植株(圖2-D～圖2-H)、愈傷組織(圖2-I、圖2-J)。其中，處理1～7的植物形態(tài)(圖2-B～圖2-H)生長勢較好，呈(深)綠色、無玻璃化、無黃化、健壯。

表2 盆栽菊花香草水晶生根培養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 盆栽菊花香草水晶外植體滅菌效果

處理間菊花莖段生長量和增殖量的差異明顯(表4)：較低的成株(芽)率是處理7、8、9，分別為48.00%、0、0，其余處理(處理1～處理6)的成株(芽)率變化范圍為80.00%～92.00%；處理間的株(叢芽)高范圍為1.63～3.40 cm；處理間節(jié)間距(范圍為0.18～0.31 cm)和莖粗(范圍為0.87～0.98 mm)的差異均不顯著(P>0.05)；處理1、2的增殖系數(shù)(分別為17.95、12.30)均顯著大于其他處理(范圍為4.90～7.10)(P<0.05)。

表1、圖2、表4顯示，處理1～處理6(基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS或1/2MS、6-BA含量為0.5～2.0 mg/L、NAA含量為0.01～0.10 mg/L、白砂糖含量為20～30 g/L)具有較高的成株(芽)率和增殖系數(shù)(4.90～17.95)，其中處理1的增值系數(shù)最大，且處理1～處理6均具有較好生長勢的植物形態(tài)。因此，菊花增殖繼代的適宜培養(yǎng)基是MS(或1/2MS)+6-BA 0.5～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L+白砂糖20～30 g/L，最佳培養(yǎng)基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L+白砂糖20 g/L。

2.4 生根培養(yǎng)

處理間成株率差異明顯，變化范圍為20.00%～95.56%；處理間的生根率(范圍為86.67%～100.00%)差異較小，生根率>90.00%的處理占83.33%，其中處理1、10、24成株率和生根率均>90%；處理間的株高范圍為1.58～4.84 cm，莖粗范圍為0.75～1.19 mm，葉片數(shù)范圍為6.70～13.90張，生根數(shù)范圍為2.50～8.20條，根長范圍為1.64～5.94 cm，根粗范圍為 0.13～0.46 mm(表5)。說明菊花比較容易生根，但處理間的菊花植株生長量和生根量的差異卻較大。

處理間菊花的根發(fā)生和植株生長勢的差異明顯(表6)。菊花主要從基部(無愈傷組織)或(和)基部愈傷組織的部位處生根，植株生長勢有較好、一般、較差。根系發(fā)生和植株生長勢均較好的特征是根從基部(無愈傷組織)發(fā)出，植株健壯、深綠、筆直、整齊、無玻璃化、無黃化，如處理10、24(表6、圖3)。

綜合分析成株率、生根率、根發(fā)生和植株生長勢等，菊花生根的最佳培養(yǎng)基是處理10(MS+AC 0.1%)、處理24(1/2MS+IBA 0.5mg/L+AC 0.1%)，其生根培養(yǎng)效果較好(圖3)。

不同因素及其不同水平對菊花生根培養(yǎng)中的成株率、生根率、株高、莖粗影響差異明顯(表2、表7)。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS或1/2MS、NAA含量為0～0.05 mg/L、IBA含量為0～0.2 mg/L、IAA含量為0～0.1 mg/L時，菊花的成株率、生根率、株高、莖粗總體上均具有較大的水平均值(表2、表7)。

表4 不同處理對盆栽菊花香草水晶增殖培養(yǎng)中莖段生長量和增殖量的影響

因此，菊花適宜生根培養(yǎng)基為MS(或1/2MS)+NAA 0～0.05 mg/L+IBA 0～0.2 mg/L+IAA 0～0.1 mg/L+AC 0.1%，試驗(yàn)篩選出的處理10屬于此范圍。

3 討論與結(jié)論

在有關(guān)菊花莖尖組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的報(bào)道中：莖尖的滅菌方法是0.1% HgCl2(無或添加吐溫)滅菌1.5～8.0 min，適宜的初代培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.1 mg/L(或IAA 1.0 mg/L)，適宜的增殖繼代培養(yǎng)基是 MS+6-BA 1.0～5.0 mg/L+NAA 0.01～0.5 mg/L(或IAA 0.8 mg/L)，適宜的生根培養(yǎng)基是1/2MS+NAA 0.1～0.2 mg/L(或IAA 1.0mg/L)[5，7，9，18]。這些報(bào)道與本研究主要區(qū)別于：(1)正交設(shè)計(jì)是植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究中一種重要的、常用的方法[19]，其應(yīng)用于菊花組織培養(yǎng)試驗(yàn)研究中的報(bào)道較少[20-21]，本研究進(jìn)一步采用正交、對比、附加等試驗(yàn)研究方法，比較系統(tǒng)、全面、科學(xué)、準(zhǔn)確地揭示出盆栽菊花莖尖組織培養(yǎng)快繁的規(guī)律。(2)本研究基于成株(芽)率、株(叢芽)高、節(jié)間距、莖粗、增殖系數(shù)、植物形態(tài)、生根率、葉片數(shù)、生根數(shù)、根長、根粗、根發(fā)生的部位、植株生長勢等13個指標(biāo)構(gòu)成種苗的綜合素質(zhì)來試驗(yàn)分析培養(yǎng)基與種苗綜合素質(zhì)的關(guān)系，據(jù)此篩選出能育出優(yōu)良綜合素質(zhì)菊花種苗的適合或最佳培養(yǎng)基，而已有的報(bào)道幾乎沒有涉及種苗綜合素質(zhì)。(3)本研究確定了HgCl2濃度及其滅菌時間與莖尖滅菌效果的定量關(guān)系(表3)，篩選出滅菌效果最佳的滅菌方法，而已有的報(bào)道卻沒有具體的滅菌效果。(4)本研究的初代培養(yǎng)是基于器官發(fā)生途經(jīng)(芽誘導(dǎo))，而已有的報(bào)道大多為愈傷組織發(fā)生途經(jīng)。(5)本研究篩選的增殖繼代培養(yǎng)的6-BA(0.5～2.0 mg/L)和NAA(0.01～0.10 mg/L)較已有的報(bào)道(分別為1.0～5.0、0.01～0.5 mg/L)偏低，這主要是由本研究基于莖段增殖和種苗綜合素質(zhì)來篩選培養(yǎng)基的，而已有的報(bào)道大多是先增殖擴(kuò)繁愈傷組織，分化出芽后再進(jìn)行芽的增殖。已有報(bào)道中的增殖階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，本研究提出1/2MS也可以用作增殖階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。有研究表明，當(dāng)增殖階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由MS變?yōu)?/2MS時，會影響植物形態(tài)的發(fā)育分化，如生長勢變?nèi)酰瑴\綠或黃化或偏黃等[22-23]，而本研究菊花的植物形態(tài)在同類情況下(由MS變?yōu)?/2MS)的增殖分化未受到明顯影響(表1、圖2)，說明菊花比較容易分化，其增殖分化階段的正常生長發(fā)育對營養(yǎng)物質(zhì)需求量的范圍較寬。(6)已有報(bào)道中的生根培養(yǎng)基(對應(yīng)本研究的生根培養(yǎng)試驗(yàn)處理21)雖能使菊花生根和生長，但菊花根系的基部附有中度愈傷組織(表2、表6)，本研究從24個處理中篩選出了生根培養(yǎng)效果更佳的培養(yǎng)基：植株根系基部無愈傷組織，生長健壯、深綠、筆直、整齊、無玻璃化、無黃化(表6、圖3)。當(dāng)生根階段的基礎(chǔ)培養(yǎng)基由MS變?yōu)?/2MS、1/4MS時，菊花植株的生長勢會隨之遞減變?nèi)?表2、表6)，這與其他作物生根培養(yǎng)上的同類表現(xiàn)情況相似[22]，說明基礎(chǔ)培養(yǎng)基對盆栽菊花的生根培養(yǎng)影響較大。本研究表明活性炭總體可以減少生根培養(yǎng)植株基部的愈傷組織，促進(jìn)盆栽菊花的生根和生長，如處理23和24(表2、表6)，這與其他作物生根培養(yǎng)上所述的觀點(diǎn)[23-24]相一致，說明活性炭是盆栽菊花生根培養(yǎng)基的必需成分。筆者研究提出了盆栽菊花生根適合培養(yǎng)基的選取范圍，為其他類型菊花(切花型菊花、造型菊花等)生根培養(yǎng)基的篩選提供重要參考。

表5 不同處理對盆栽菊花香草水晶生根培養(yǎng)中植株的生長量和生根量的影響

表6 不同處理對盆栽菊花香草水晶生根培養(yǎng)中植株的根發(fā)生和生長勢的影響

表7 不同因素對盆栽菊花香草水晶生根培養(yǎng)中4個主要指標(biāo)的極差分析