長三角地區果蔬灰霉病病菌對5種殺菌劑的抗藥性檢測

盧曉雪， 聶國嬡， 孫海燕， 張金鳳， 陳懷谷， 魏利輝

(江蘇省農業科學院植物保護研究所，江蘇南京 210014)

果蔬灰霉病是由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的真菌病害，目前已經成為一種全球范圍的真菌病害。灰葡萄孢寄主范圍廣，可以侵染多種蔬菜、果樹以及其他經濟作物，一旦發病就會給農業生產造成重大危害[1]。灰霉病的防治一直是一個重要問題，目前生產上主要以化學防治為主，化學防治主要有苯胺基嘧啶類嘧霉胺、苯并咪唑類多菌靈、二甲酰亞胺類腐霉利等[1-2]。灰霉病病菌具有寄主范圍廣、遺傳變異快等特點，且由于連續長期單一使用化學藥劑，灰霉病病菌已經對上述藥劑產生抗藥性，這在國內外多個地區的多種作物上均有報道[3-4]。已有研究表明，江蘇、浙江以及安徽等地區草莓、黃瓜、番茄等寄主上的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等傳統殺菌劑產生了較高的抗藥性[5-7]。

咯菌腈和啶酰菌胺是生產上登記防治灰霉病病菌效果較好的新型殺菌劑，其中咯菌腈最初于2009年在我國登記使用，用于防治菊花灰霉病[1]，目前關于灰霉病病菌對咯菌腈產生抗藥性的報道較少[8]。啶酰菌胺是屬于新型煙堿類殺菌劑，在21世紀初引入我國，用于防治黃瓜灰霉病，對灰霉病病菌具有較好的防治效果[9-10]。但在國內外不同地區，已有關于灰霉病病菌對啶酰菌胺產生抗藥性的報道，2010年Avenot等報道了啶酰菌胺的田間抗性菌株[11]，2012年余玲等在山西省發現了對啶酰菌胺產生抗性的菌株[12]。

由于灰霉病病菌的抗藥性在生產上造成的一系列問題[13-14]，同時為了綜合評價長三角地區果蔬灰霉病病菌對傳統型殺菌劑和新型殺菌劑的抗藥性現狀，筆者從我國江蘇、浙江、上海等9個地區，在番茄、草莓、萵苣等6種果蔬產區采集灰霉病病樣，采用最低濃度抑制法檢測灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺等的抗藥性，以期為不同地區不同作物灰霉病的田間用藥和化學防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株的采集與純化

2013—2014年，在鹽城、淮安、鎮江、揚州、南通、蘇州、上海、嘉善、寧波等9個地區的塑料大棚內，采集來自草莓、黃瓜、番茄、萵苣、瓠瓜、西瓜等6種果蔬作物的病葉或病果，病葉或病果放于自封袋中帶回實驗室，在無菌條件下，經過分離純化共得到210個灰葡萄孢單孢株系，轉移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，簡稱PDA)培養基斜面上，保存于 4 ℃ 冰箱中備用。菌株的詳細信息如表1所示。

表1 待測灰霉病病菌菌株信息

1.2 供試藥劑

95%嘧霉胺原藥，購自江蘇豐登農藥有限公司；98%多菌靈原藥，購自江蘇省江陰凱江農化有限公司；98%腐霉利原藥，購自江西禾益化工股份有限公司；96%咯菌腈原藥，購自江蘇省無錫路浩化工有限公司；98%啶酰菌胺原藥，購自河北美星化工有限公司。

98%多菌靈原藥用0.1 mol/L HCl溶液溶解成 1 000 μg/mL 母液，其他原藥均用少量丙酮溶解配制成 1 000 μg/mL 母液，均貯存于4 ℃冰箱待用。

1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g切成小塊，加水煮爛，用紗布過濾，加入15 g瓊脂，10 g葡萄糖，補足 1 000 mL 去離子水。PDA培養基用于灰霉病病菌的分離、菌株保存以及灰霉病病菌對多菌靈、腐霉利、咯菌腈的抗藥性測定。根據Chapeland等的方法[4]配制培養基用于灰霉病病菌對嘧霉胺的抗藥性測定，培養基配方：10.0 g葡萄糖，1.5 g磷酸氫二鉀，2.0 g磷酸二氫鉀，1.0 g硫酸銨，0.5 g硫酸鎂，16.0 g 瓊脂，1 000 mL去離子水。水瓊脂培養基：15 g瓊脂，1 000 mL 去離子水。水瓊脂培養基用于灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性測定。上述3種培養基均于121 ℃高壓濕熱滅菌20 min，冷卻后貯藏備用。

1.4 果蔬灰霉病病菌對5種殺菌劑的抗藥性測定

采用最低濃度抑制法，嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺分別以1.0、1.0、5.0、0.5、5.0 μg/mL作為鑒別濃度，并以此制備含藥平板。

灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利、咯菌腈的抗藥性檢測方法：將待檢測的灰霉病病菌菌株接入PDA培養基平板上，于25 ℃黑暗培養96 h后，取直徑為5 mm的菌片至各含藥培養基平板中，以無藥平板為對照，每個處理3次重復，25 ℃ 黑暗培養72 h后觀察菌株生長情況，與不含藥的培養基平板相比，不能或幾乎不能在該濃度的含藥培養基平板上正常生長的菌株為敏感菌株，能正常生長的菌株為抗性菌株。

灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性檢測方法：參照潘金菊等的方法[15]，檢測啶酰菌胺對灰霉病病菌孢子萌發的影響。將待檢測的灰霉病病菌菌株接入PDA培養基平板上，于 25 ℃ 黑暗培養5 d至菌絲長滿平板后，黑光燈誘導灰霉病病菌產孢，在25 ℃條件下誘導3～5 d，收集灰霉病病菌的孢子并過濾除去菌絲，調至100倍顯微鏡下每個視野30～40個孢子，將100 μL孢子懸浮液均勻地涂布在含藥的水瓊脂培養基平板上，以無藥水瓊脂培養基平板為對照，每個處理3次重復，25 ℃黑暗培養12 h后，觀察孢子萌發情況，與不含藥的培養基平板相比，不能或幾乎不能在該濃度的含藥培養基平板上正常生長的菌株為敏感菌株，能正常生長的菌株為抗性菌株。

統計各個地區各個寄主上灰霉病病菌的抗性菌株的發生頻率。抗性頻率=抗性菌株數/測定總菌株數×100%。

2 結果與分析

2.1 長三角地區果蔬灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性

2013—2014年從長三角的9個地區、6種不同果蔬作物的病葉或病果上采集分離得到210株灰霉病病菌菌株，采用最低濃度抑制法檢測這些菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等3種傳統殺菌劑的抗藥性。由表2可知，210株灰霉病病菌菌株對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性較高，抗性頻率分別為68.57%、70.48%、68.10%。比較210株灰霉病病菌菌株的抗藥性結果發現，采自不同地區、不同寄主的灰霉病病菌對同種藥劑的抗藥性不同，但采自同一地區、同種寄主的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率總體上差異較小。總體來看，在所有采集灰霉病病菌菌株的9個地區，僅揚州地區的灰霉病病菌對3種藥劑的抗性頻率均較低，采自鹽城、淮安、鎮江、南通、蘇州、上海、嘉善、寧波等地區的灰霉病病菌對上述3種傳統藥劑均產生了較高的抗藥性。由表3可知，對于不同寄主上的灰霉病病菌來說，從草莓、黃瓜和番茄的病葉或病果上分離的灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗藥性較高；此外，采自萵苣、瓠瓜上的灰霉病病菌也檢測到了部分抗性菌株，但由于在這2種寄主上分離得到的灰霉病病菌數量較少，若要準確評價其抗藥性，須進行后續的樣品采集和抗藥性檢測工作。綜合上述結果發現，嘧霉胺、多菌靈、腐霉利這3種傳統殺菌劑對長三角不同地區、不同寄主上的灰霉病病菌的抑制效果較差。

2.2 長三角地區果蔬灰霉病病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗藥性

為了綜合評價長三角地區果蔬灰霉病病菌對傳統殺菌劑和新型殺菌劑的抗藥性情況，指導生產實踐，對采自長三角不同地區、不同寄主上的210株灰霉病病菌菌株對咯菌腈和啶酰菌胺的抗藥性進行檢測。由表4可知，在210株灰霉病病菌菌株中，未檢測到對咯菌腈產生抗藥性的菌株，說明咯菌腈對灰霉病病菌具有較好的防治效果。關于灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性，檢測啶酰菌胺對孢子萌發的抑制效果，灰霉病病菌并未能在試驗過程中全部產孢，產孢率較低，經過孢子誘導條件的優化，仍有59株灰霉病病菌未能成功產孢，產孢率為71.90%，因此最終檢測151株成功產孢的灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性。

表2 長三角不同地區果蔬灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率

表3 長三角地區不同種果蔬作物上灰霉病病菌對嘧霉胺、多菌靈、腐霉利的抗性頻率

表4 長三角不同地區果蔬灰霉病病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗性頻率

由表4、表5可知，全部檢測的151株成功產孢的灰霉病病菌中，在5.0 μg/mL鑒別濃度下，檢測到23株對啶酰菌胺產生抗藥性的菌株，抗性頻率為15.23%。從不同地區菌株的抗性頻率來看，不同地區之間菌株抗性差異較大，淮安、嘉善、寧波等地區菌株的抗性頻率較高，但由于檢測的菌株數量較少，須要進行后續的菌株采集和抗藥性檢測工作，進一步評價這3個地區菌株的抗藥性；蘇州地區的菌株抗性頻率較高，達到26.32%；南通、上海等地區的菌株抗性頻率較低，鹽城、鎮江、揚州等地區未發現對啶酰菌胺產生抗藥性的菌株。對于采自不同寄主菌株的抗藥性來說，黃瓜和瓠瓜上的灰霉病病菌抗藥性較高，萵苣和西瓜上未發現對啶酰菌胺產生抗藥性的菌株，但因菌株數量較少，須要進行后續的菌株采集和抗藥性檢測工作，進一步評價上述4種寄主上灰霉病病菌的抗藥性；在草莓和番茄上發現了抗性菌株，但抗性頻率也較低。綜上所述，在長三角地區部分地區不同果蔬品種上檢測到對啶酰菌胺產生抗性的菌株，但抗性頻率較低。

表5 長三角地區不同種果蔬作物上灰霉病菌對咯菌腈和啶酰菌胺的抗性頻率

3 討論與結論

灰霉病病菌給農業生產造成了極其嚴重的危害[16-17]，長期以來用于防治果蔬灰霉病的傳統殺菌劑主要包括嘧霉胺、多菌靈、 腐霉利等[18]。這些傳統的化學防治藥劑均已發現抗性菌株，這些藥劑在農業生產中的防治效果較差，在國內外關于很多地區都相繼報道了灰霉病病菌對一些傳統的化學防治藥劑產生了較高的抗藥性[18-20]。

本研究綜合評價了長三角不同地區不同寄主上的灰霉病病菌對上述3種傳統殺菌劑的抗藥性情況，結果表明，從長三角9個地區、6種果蔬作物采集分離得到的210株灰霉病病菌，對3種殺菌劑均表現出很高的抗性水平，抗性頻率分別為68.57%、70.48%、68.10%。除揚州地區外，其他8個地區的灰霉病病菌均對上述3種殺菌劑產生了較高抗藥性；除采自部分寄主上的灰霉病病菌菌株數較少外，草莓、黃瓜、番茄上的灰霉病病菌對上述3種殺菌劑均產生了較高抗藥性。表明3種傳統型對長三角地區灰霉病的防治效果較差，說明在農業生產中須要選擇新型替代殺菌劑防治果蔬灰霉病。

咯菌腈和啶酰菌胺是防治果蔬灰霉病效果較好的新型殺菌劑[21]，檢測采自長三角地區的210株灰霉病病菌對這2種殺菌劑的抗藥性，未發現對咯菌腈產生抗藥性的菌株，說明咯菌腈對灰霉病病菌具有較好的防治效果，對咯菌腈的使用應做好抗性預防工作。

在成功產孢的159株灰霉病病菌菌株中，檢測到對啶酰菌胺產生抗性的菌株有23株，抗性頻率為15.23%，抗性頻率較低；除了部分檢測菌株數較少的地區外，蘇州地區灰霉病病菌對啶酰菌胺的抗藥性較高，抗性頻率達26.32%；說明啶酰菌胺對灰霉病的總體防治效果較好，但部分地區的灰霉病病菌對啶酰菌胺已經產生了較高的抗藥性。Veloukas等證實，近年來由于該藥劑的大量使用，已經導致啶酰菌胺對灰霉病病菌的防治效果下降[22]。紀軍建等的研究也表明，咯菌腈在防治灰霉病時可作為首選藥劑，啶酰菌胺在防治灰霉病時可作為候選藥劑[23]。

綜上所述，咯菌腈在防治灰霉病時效果最好，啶酰菌胺的效果次之，檢測到對啶酰菌胺產生抗性的菌株，藥劑的田間使用應做好抗性預防工作，同時注意抗藥性暴發的風險；對不同地區、不同寄主上的灰霉病病菌的抗藥性進行重點監測，指導科學用藥。在藥劑抗性嚴重的地區或寄主上，應減少該類藥劑的使用次數或使用量，盡量避免單劑使用。建議停止使用嘧霉胺、多菌靈、腐霉利等高抗藥劑，推薦使用吡咯類殺菌劑，如咯菌腈等，或煙酰胺類殺菌劑，如啶酰菌胺等，但使用時仍應注意藥劑的用量，并注意與不同作用機制的殺菌劑復配或交替使用。