混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發的影響

詹振楠， 馬 青， 王文娟， 納 偉

(寧夏葡萄酒與防沙治沙職業技術學院，寧夏銀川 750001)

土壤鹽漬化是世界上最為嚴重的生態環境問題之一，預計到2050年，50%以上的耕地會發生不同程度鹽堿化，這將會嚴重影響土地利用率和農作物產量[1]。中國鹽堿化土地面積已近1億hm2，潛在鹽堿地面積達1 733萬hm2[2]，其中，東北松嫩平原、新疆維吾爾自治區、內蒙古河套灌區、寧夏引黃灌區鹽堿化土地面積分別約為370萬、847.6萬、111.9萬、46.58萬hm2[3]，而不同地區因受自然條件及氣候差異的影響，其鹽堿地類型較為復雜，多為復合鹽堿地，即鹽化和堿化相伴存在。鹽生環境中，種子萌發是植物生存和延續至關重要的階段[4]，更是植物能否適應環境變化并成功建植的關鍵[5]。有研究表明，堿性鹽脅迫比中性鹽脅迫對植物的生化破壞力更強[6]。目前，研究NaCl、NaHCO3、Na2CO3等單一鹽或堿脅迫下植物種子萌發情況的較多，而復雜混合鹽堿對種子萌發影響的研究僅在牧草、糧食等作物上[7-9]。

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)為茄科枸杞屬多年生耐鹽、抗旱植物[10]，主要分布于我國陜西省北部、寧夏回族自治區、內蒙古自治區、甘肅省、青海省、新疆維吾爾自治區等地[11]，成熟漿果富含紫紅色素和微量元素，是一種天然的珍稀花色苷類色素資源，有作為藥用植物資源開發的物質潛力[12]。目前，有關黑果枸杞的研究報道主要集中在黑果枸杞基因與遺傳多樣性、抗氧化成分測定分析、組織培養快繁技術、NaCl與MgSO4單鹽脅迫下生理指標測定及其種子萌發特性等方面[5，12-18]，而有關混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發的影響鮮見報道。為此，本試驗通過研究不同pH值條件下混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發過程及萌發恢復的影響，以探討黑果枸杞種子萌發的耐鹽、耐堿能力及鹽堿脅迫下的生理萌發機制，以期為黑果枸杞的大面積推廣和西北地區鹽堿地、荒漠化土地的利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑果枸杞種子，由寧夏中寧縣國家枸杞良種基地提供，該基地位于寧夏回族自治區中寧縣城東部，海拔1 170～1 180 m，地理坐標為105°26′～106°07′ E、37°09′～37°50′ N。地域四面環山，光照充足，干旱少雨，蒸發強烈，有效積溫高，風大沙多，日照時間長，晝夜溫差大，是典型的溫帶大陸性季風氣候，全年日照時數為2 800 h，年平均氣溫為9.5 ℃，無霜期159～169 d，年均降水量200 mm左右，蒸發量1 830～1 950 mm。

1.2 鹽堿脅迫條件設計

試驗選擇中性鹽NaCl、Na2SO4和堿性鹽NaHCO3、Na2CO3，以堿性鹽所占比例由小到大順序分為4個處理組，依次標記為A、B、C、D(表1)，在預試驗基礎上，每1個處理組設定50、100、150、200 mmol/L這4個鹽處理濃度梯度，且每個處理組采用相同測定的pH值，以蒸餾水處理為對照(CK)。采用雷磁PHS-3E型 pH計測定各溶液的pH值。

表1 各處理組NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3配比及pH值

1.3 黑果枸杞種子萌發試驗

試驗于2017年11月至2018年3月在寧夏葡萄酒與防沙治沙職業技術學院植物生理實驗室進行，采用紙上發芽床法。挑選飽滿一致的種子，0.1%高錳酸鉀溶液殺毒30 min；蒸餾水反復沖洗5遍，晾干，備用；在直徑為90 mm的培養皿中放入雙層濾紙，整齊擺入60粒種子，分別加入不同濃度的鹽堿溶液，直到濾紙飽和為止，以傾斜45°無明水為準，每處理重復3次；加蓋，(25±1) ℃恒溫培養箱中避光培養；萌發過程中，每隔2 d更換1次相應的鹽堿溶液，以保證溶液濃度的一致性；種子萌發以肉眼看到白色幼根為標準，每隔24 h觀察記錄萌發種子數，連續觀察13 d[14]，同時，將未萌發的種子用蒸餾水反復沖洗5～6次，轉至蒸餾水中繼續培養13 d，檢測種子的恢復萌發情況。統計種子萌發率(GP)、發芽指數(GI)、發芽勢(GE)、相對鹽害率(Rd)、恢復萌發率，計算公式分別為：

GP=GN/SN×100%；

GI=∑(Gt/Dt)；

GE=4 d內發芽種子數/SN×100%；

Rd=(CK處理的發芽率-鹽堿溶液處理的發芽率)/CK處理的發芽率×100%；

恢復萌發率=(a-b)/(c-d)×100%[19]。

式中，GN、SN、Gt分別為種子萌發總數、供試種子總數、當日萌發種子數，單位為個；Dt為相應的萌發天數，d；a、b、c、d分別為全部時間的發芽種子數、鹽堿脅迫溶液中的發芽種子數、供試種子數、復水前萌發的種子數，單位為粒。

1.4 數據處理

采用SPSS 19.0、Excel 2003軟件對試驗數據進行統計和單因素方差分析，采用最小差異顯著法(LSD法)檢驗處理間的差異顯著性，采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發的影響

2.1.1 萌芽率 由圖1可見，4組不同濃度混合鹽堿脅迫條件下，黑果枸杞種子的萌發曲線趨勢相似，隨調查天數的延長，種子萌芽率呈緩慢增加趨勢，且隨處理pH值的增加(處理A至處理D)，種子萌發率下降明顯；同一處理組條件下，隨鹽堿脅迫濃度的增加，各處理組的種子萌發率呈下降趨勢。

由表2可見，連續觀察13 d時，黑果枸杞種子對照組的萌發率為65.6%；脅迫處理鹽堿濃度為50 mmol/L時，各處理組黑果枸杞種子的萌發率較對照下降顯著(P<0.05)；混合鹽堿濃度為100 mmol/L時，A處理組的黑果枸杞種子的萌發率為16.1%，而其他處理組的種子萌發率相互間差異較小；脅迫處理鹽堿濃度大于100 mmol/L時，各處理組黑果枸杞種子的萌發率為5.0%～7.8%，相互間差異較小。

表2 不同鹽堿脅迫下黑果枸杞種子的萌發率

2.1.2 發芽勢與發芽指數 由表3可見，隨鹽堿脅迫濃度的增加，各處理組黑果枸杞種子的發芽勢、發芽指數呈下降趨勢，相對鹽害率呈增加趨勢，對種子萌發的抑制作用愈加明顯；對照處理的黑果枸杞種子發芽勢、發芽指數分別為40.6%、16.4，顯著高于各處理組不同濃度處理的發芽勢、發芽指數(P<0.05)；鹽堿處理濃度從50 mmol/L增加到 200 mmol/L，A組黑果枸杞種子發芽勢、發芽指數分別從17.2%、7.7下降到3.9%、2.2，D組黑果枸杞種子發芽勢、發芽指數分別從6.1%、2.9下降到2.2%、1.4；對同一處理濃度而言，隨pH值的增加(處理A至處理D)，枸杞種子發芽勢、發芽指數整體呈下降趨勢，而相對鹽害率呈上升趨勢。

2.1.3 恢復萌發率與最終萌發率 試驗結果表明，連續觀察13 d后解除脅迫，不同濃度鹽堿脅迫處理的黑果枸杞種子復水1 d均有部分種子恢復萌發。由表2可見，各處理的種子恢復萌發率均顯著高于CK，最終萌發率均有不同程度的增加(P<0.05)，而CK處理的黑果枸杞種子不再有新的種子萌發；隨脅迫鹽堿濃度的增加，A、B處理組的黑果枸杞種子萌發恢復率呈倒“V”形降低[20]，均在鹽堿濃度為100 mmol/L時恢復萌發率相對最高，分別為49.0%、28.0%；C、D處理組的黑果枸杞種子恢復萌發率均在鹽堿濃度為50 mmol/L時相對最低，分別為16.3%、12.8%，且100～200 mmol/L鹽堿濃度脅迫下的黑果枸杞種子恢復萌發率相互間差異不顯著(P>0.05)，高鹽堿脅迫下的種子最終萌發率差異較小：隨處理鹽堿濃度的增加，各處理組黑果枸杞種子的最終萌發率呈下降趨勢，而對同一處理濃度而言，隨pH值的增加(處理A至處理D)，黑果枸杞種子的最終萌發率也呈下降趨勢。因此，高鹽堿的環境不但破壞黑果枸杞種子的活力，還抑制黑果枸杞種子的萌發。

表3 混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發參數的影響

2.2 鹽堿濃度、pH值及其交互作用對黑果枸杞種子萌發參數的影響

由表4可見，鹽堿濃度、pH值及其交互作用對黑果枸杞種子的發芽率、發芽指數均有極顯著影響，鹽堿濃度對黑果枸杞種子的發芽率、發芽勢、發芽指數有極顯著影響(P<0.01)；pH值及鹽堿濃度與pH值交互作用對黑果枸杞種子發芽勢的影響不顯著(P>0.05)。因此，鹽堿濃度是影響黑果枸杞種子萌發的決定性主導因素，pH值次之。

表4 鹽堿濃度、pH值及其交互作用對黑果枸杞種子各萌發參數的影響

3 結論與討論

土壤鹽漬化已成為導致全球可利用耕地日益減少、限制作物產量和品質提高的主要非生物逆境之一[9]，關于耐鹽植物如何適應鹽堿逆境已成為國內外專家學者們研究的熱點問題。黑果枸杞是我國西北干旱地區特有的耐鹽、抗旱野生灌木[11]，在鹽漬化和次生鹽漬化土壤上大量分布，且抗性強、適應性廣，常構成鹽爪爪-黑果枸杞的鹽生植物群落[21]，因此，研究黑果枸杞種子的耐鹽能力及鹽堿脅迫下的變化規律具有重要的科學意義和潛在的應用價值。

本研究結果表明，混合鹽堿脅迫下，黑果枸杞種子的萌發受到不同程度的影響，隨鹽堿脅迫濃度的上升，黑果枸杞種子發芽率、發芽勢、發芽指數等指標與對照相比均有不同程度下降，這與古麗內爾·亞森等的研究結論[22]一致。鹽堿脅迫對植物種子萌發的影響主要表現在種子萌發率降低、種子萌發進程延長，或者使種子失去活力[23]。本研究結果表明，黑果枸杞在蒸餾水中(對照)的萌發率相對最高，當鹽堿濃度≥100 mmol/L、pH值>8.56時，黑果枸杞種子萌發會受到嚴重抑制，萌發率均低于10%；混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發的抑制程度比復合中性鹽脅迫相對更為嚴重，這可能是除 Na+毒害和滲透脅迫外，高pH值也影響了細胞內的酶活性，阻礙了種子的發芽生長。王恩軍等研究表明，NaCl、Na2CO3脅迫下黑果枸杞種子萌發的極限閾值分別為300、100 mmol/L[18]；劉克彪等以不同鈉鹽溶液處理黑果枸杞種子發現，不同鹽分脅迫對種子萌發的影響效應不同，相同濃度不同鈉鹽處理對黑果枸杞種子萌發造成的鹽害率為NaHCO3>NaCl>復合鹽> Na2SO4[22]。本研究中，鹽堿濃度為 50 mmol/L 時，隨著堿性鹽所占比例的增加，黑果枸杞種子萌發率下降幅度相對較大，當鹽堿濃度達到200 mmol/L時，種子萌發率受到嚴重抑制，但隨pH值上升黑果枸杞種子萌發率差異較小。

另外，試驗結果表明，黑果枸杞種子在解除混合鹽堿脅迫后均表現出一定的恢復萌發能力，低濃度NaCl、Na2SO4的混合中性鹽脅迫處理的種子其恢復萌發率相對較高，其最終萌發率和對照無顯著性差異(P>0.05)，而高濃度的混合中性鹽和不同濃度的混合堿性鹽脅迫處理的黑果枸杞種子恢復萌發率相對較低，且相互間相差不大，這可能是因為未萌發的種子置于蒸餾水中解除鹽堿脅迫時，其種子內部的滲透勢相對降低，促進種子從周圍環境吸收水分，進而使種子迅速恢復萌發，但當鹽堿濃度超出黑果枸杞種子萌發的耐受范圍，細胞內累積大量離子，使細胞質膜完整性遭受破壞，胞內代謝失調，造成永久性毒害，致使種子完全喪失活力[24-25]，這與王桔紅等的研究結果[12]不同，可能是混合鹽堿脅迫對黑果枸杞種子萌發的影響比單一鹽或者混合中性鹽的脅迫更為嚴重。總之，混合鹽堿涉及到的脅迫因素比單一鹽要復雜，混合鹽堿脅迫不僅僅是鹽、堿2種脅迫的簡單疊加，而是相互間存在一定的協同效應[26]。