生菜SSR遺傳多樣性及其與營養品質性狀的關聯分析

王書珍， 黃興學， 王斌才， 張 霖， 周國林， 汪愛華

(1.經濟林木種質改良與資源綜合利用湖北省重點實驗室/黃岡師范學院生命科學學院，湖北黃岡 438000；2.武漢市農業科學技術研究院蔬菜科學研究所，湖北武漢 430065)

生菜(LactucasativaL.)(2n=18)是菊科萵苣屬1～2年生草本植物，原產地中海沿岸，現為全世界范圍廣泛種植食用的低糖、低脂類葉用類蔬菜，因能夠分解亞硝胺等致癌物質被稱為“抗癌蔬菜”，其根據葉片的長勢分為結球生菜、半結球生菜、散葉生菜等多種類型[1-2]。生菜富含蛋白質、維生素、礦物質、有機酸、核黃素、膳食纖維等活性成分，具有較高的營養和經濟價值[3]。近年來，隨著生活水平的提高，人們對蔬菜、水果以及農作物等的品質要求不斷提高，對生菜的品質要求也是逐漸提高[4]。

品質性狀是數量性狀或數量-質量性狀，其受多基因控制，且其表型極易受到周圍環境的影響[4]。控制品質性狀的基因常為隱性基因，傳統的品質檢測繁瑣且費用較高，因此農作物的品質改良工作進展緩慢。然而，尋找與品質性狀緊密連鎖的分子標記并用于分子標記輔助育種中，將大大提高品質性狀的遺傳改良效率。微衛星(simple sequence repeat，SSR)分子標記，是基因組中1～6個核苷酸多次串聯重復組成的序列，數量豐富、共顯性遺傳、多態性高，已經廣泛應用于遺傳多樣性、關聯分析、基因定位、遺傳連鎖圖譜構建、物種進化等研究中[5-6]。

本研究選用51份生菜資源構建自然群體，采用SSR標記分析其遺傳多樣性，并結合關聯分析，挖掘蛋白質、硝酸鹽、可溶性糖、硝酸鹽含量等營養品質性狀的優異等位變異，為生菜品質性狀遺傳改良育種奠定分子基礎，也為分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從國家生菜種質資源庫中挑選51份表型差異較大的資源，分別于2015、2016年秋季種植在武漢市蔬菜科學研究所的試驗基地(114°20′E、30°37′N)，種植2季，常規日常管理和病蟲害防治，

定植株行距為25 cm，各品種種植30～50株。

1.2 營養品質性狀測定

每個品種選取長勢一致且健康的植株5株，在同一位置采摘葉片，低溫保存后迅速進行營養品質的測定，各試驗重復3次。蛋白質含量的測定采用微量凱氏定氮法[7]；采用硝酸鹽試粉法測定新鮮葉片組織中的硝酸鹽含量[8]。采用蒽酮法測定生菜嫩葉的可溶性糖含量[9]。利用近紅外光譜技術測定生菜葉片纖維素的含量[10]。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴增

每個品種隨機選5株，每株采集3張健康嫩葉，硅膠干燥并自封袋封存。采用改良的CTAB法提取基因組DNA，稀釋到100 ng/μL[11]。依據NCBI數據庫的生菜EST序列信息，設計合成80對SSR引物。PCR反應體系(15 μL)：1 μL的基因組DNA(100 ng/μL)，20 mmol/L正反向引物各0.15 μL，7.5 μL的2×TaqPCR Mastermix，滅菌的去離子水補足體積。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，最適退火溫度下退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個擴增循環；72 ℃延伸 5 min。采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠檢測PCR擴增產物，依據20 bp DNA marker的電泳譜帶，統計不同個體相應位點上等位基因的大小。

1.4 數據統計與分析

根據電泳圖譜構建“0/1”二元矩陣：同一電泳位置上有帶記為“1”，無帶記為“0”。對蛋白質、硝酸鹽、可溶性糖、纖維素含量的測定數據進行方差分析和聚類分析，統計各性狀的平均值、變異系數、重復力(R)大小[12]。使用Arlequin 3.1軟件統計等位基因數(Na)、期望雜合度(HE)、觀察雜合度(HO)等多樣性參數[11，13]。利用PICCalc 0.6軟件計算各標記的多態性信息(PIC)含量。采用NTSYS-PC(version 2.2)軟件計算遺傳相似系數，根據遺傳距離構建聚類圖[14]。根據遺傳距離矩陣分析SSR標記位點與形態性狀的相關性[12]。

2 結果與分析

2.1 生菜營養品質性狀分析

本研究所選的51份生菜資源變異較大，方差分析表明，4個營養品質性狀在不同的生菜資源間均達到極顯著水平。生菜葉片蛋白質平均含量高達10.914 mg/g，硝酸鹽平均含量為1.016 mg/g，可溶性糖平均含量為2.286%，而纖維素平均含量為0.019%(表1)。蛋白質含量的變化幅度最大，為 2.211～35.423 mg/g，極差高達33.213 mg/g。4個營養品質性狀的變異系數(CV)在0.124%～0.624%間變化，其中蛋白質含量的變異系數最大，最小的是纖維素含量。4個品質性狀的重復力(R)變化范圍為0.865～0.973，重復力最低的是纖維素含量，最高的是蛋白質含量(表1)。

依據4個營養品質性狀構建的聚類分析圖，51份生菜資源被分為兩大類，LS1、LS2、LS23等3份生菜構成第1類，其余的48份被聚為第2類(圖1)。在遺傳距離3.73處，第二大類又被分為2個小類，分別包括LS3、LS11等在內的21份資源和包括LS4、LS17等在內的27份資源。營養品質性狀類似的生菜品種被聚到一起，研究發現聚類結果與地理起源并不一致。

表1 各品種間品質性狀變異情況

2.2 SSR標記的多態性分析

在所設計合成的80個EST-SSR標記中有34個能夠特異性擴增出目的大小的DNA片段，且重復性強；12個以(AG)n或者(CT)n為重復基序的標記在51份生菜資源中是多態的。多態性SSR標記的退火溫度為53～58 ℃，微衛星基序重復次數介于24～27次之間。12個標記共擴增出等位基因類型62種，片段大小為124～237 bp。每個標記檢測到的等位基因數為3～9個，平均為5.167個。標記LswSS10檢測到的等位基因數最多，為9個，其次是LswSS6，檢測到8個等位基因位點。LswSS1、LswSS9、LswSS11等3個SSR標記擴增效率最低，僅擴增出3個等位基因(表2)。

觀察雜合度(HO)和期望雜合度(HE)的變化范圍分別為0.00～0.273和0.545～0.842，平均值分別為0.106和0.687(表2)。12個標記間的連鎖不平衡度并未達到極顯著水平，并且12個位點處均出現HO小于HE的情況，即雜合子嚴重缺失。LswSS4、LswSS5、LswSS7、LswSS8等4個位點的HO均為0，即此4個位點在檢測的生菜資源中均是純合位點。多態性信息含量(PIC)值變化范圍為0.428～0.803，平均為 0.614。除了LswSS11標記，其余11個位點的PIC值均大于或等于0.500，即生菜資源內存在豐富的遺傳多樣性。

2.3 營養品質性狀與SSR標記關聯分析

將4個營養品質性狀的距離矩陣與SSR標記的距離矩陣進行相關性分析，擬合方程為y=0.464 8x+1.322，二者的相關系數為-0.02841，相關性并不顯著。為了分析每個標記位點對4個營養品質性狀的貢獻率，將4個營養品質性狀數據進行聚類，12個SSR擴增帶譜也分別聚類，再將蛋白質、硝酸鹽、可溶性糖和纖維素含量等4個性狀的距離矩陣與單個SSR標記聚類的距離矩陣進行相關性分析。在進行的兩兩相關分析中，并未找到與蛋白質含量和硝酸鹽含量性狀關聯的SSR分子標記。LswSS1和LswSS11兩個標記與生菜葉片可溶性糖含量顯著相關，相關系數分別為-0.214和 -0.260(表3)。與纖維素含量相關的SSR標記有3個，分別為LswSS1(r=-0.366)、LswSS3(r=-0.208)以及LswSS12(r=-0.261)。然而，包括LswSS2、LswSS4、LswSS5、LswSS6、LswSS7、LswSS8、LswSS9、LswSS10等在內的8個SSR標記與四個營養品質性狀的相關性都不顯著。

表2 12個SSR多態性標記信息

表3 與品質性狀相關聯的SSR標記信息

3 討論與結論

關聯分析(association analysis)是利用基因或者標記間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)關系，對表型性狀與基因或標記位點間的相關性進行分析，從而鑒定與表型變異相關的基因位點[15]。關聯分析采用的是自然群體，研究周期短，且可以同時分析同一位點上的多個等位基因，自然群體在長期進化過程中積累了大量的重組信息，做出來的關聯圖譜精確度也比較高[16]。于志遠等利用關聯分析方法檢測到11個與大豆蛋白質含量極顯著關聯的SSR標記，解釋率為2.65%～9.08%[17]。馮英娜等篩選到與茄子農藝相關性狀顯著相關(P<0.05)的SSR標記17個[18]。嚴玫等采用關聯分析法檢測出與花生品質性狀關聯的SSR位點4個，總等位變異位點40個[19]。

生菜葉片的營養品質性狀屬于連續變異的數量性狀，是基因和環境共同作用的結果，其遺傳基礎復雜，目前由于很難找到表現型和基因型之間的對應關系，因此品質性狀機理和遺傳改良等研究十分困難。本研究將51份生菜資源種植在條件一致的苗圃地，采用完全隨機區組設計，最大程度上消除了環境因素引起的個體表型差異。本研究共檢測到的12個多態性位點均出現觀察雜合度顯著低于期望雜合度的現象，可能的原因是在生菜長期選育過程中，部分位點出現了極大的純合化。最后利用關聯分析法篩選出2個與生菜葉片可溶性糖含量相關的SSR標記，3個與纖維素含量相關的SSR標記，并且LswSS1標記與2個營養品質性狀均相關。

本研究篩選到的營養品質性狀關聯的SSR標記對于后期克隆生菜營養品質性狀相關目的基因意義重大，本研究結果也為生菜品質性狀的遺傳改良和新品種選育奠定了基礎。然而，關聯位點與性狀間關系及作用機理和方式尚不清楚，而進行全基因組的關聯分析則能找出更多與品質性狀關聯的分子標記，后續仍需更加深入的研究。