孔雀魚胚后發(fā)育的器官組織學發(fā)生研究

方珍珍， 范 強， 陶秉春， 陳成勛

(天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院/天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

孔雀魚(Poeciliareticulata)別稱彩虹魚、虹鳉、花鳉、百萬魚，英文名guppy，原產(chǎn)于南美洲和西印度群島，孔雀魚屬鳉形目(Cyprinodontiformes)胎鳉科(Poeciliidae)[1]。因其游動起來美麗的花尾巴猶如孔雀開屏，故名孔雀魚。目前國內(nèi)外對該魚的研究涉及多個領域，如繁殖生物學領域[2]、生化遺傳學領域[3-5]等，對其胚胎學的研究有胚胎心血管發(fā)育等[6]，涉及其器官組織發(fā)生的有精子的發(fā)生等[7]，并對其滯后育雛[8]、體長分化[9]及胚心的體外培養(yǎng)[10]等進行了研究。本研究對即將產(chǎn)魚及剛產(chǎn)后的孔雀魚整體固定后，經(jīng)常規(guī)石蠟組織切片技術制成組織切片，用生物顯微鏡對器官組織發(fā)生進行較系統(tǒng)的組織學觀察。旨在通過對母體內(nèi)幼魚的器官、組織進行觀察，獲取相關資料，以期為孔雀魚的器官組織發(fā)生研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2015年4月取自天津農(nóng)學院水產(chǎn)養(yǎng)殖中心實驗室Ⅲ養(yǎng)殖的孔雀魚，當雌魚肛門2側的胎斑變大變黑時，即是臨產(chǎn)征兆[11]，6尾試驗用魚平均體長為2.3 cm，平均體質(zhì)量為 1.5 g。

1.2 方法

先后挑取6尾體質(zhì)健壯、無傷無病的臨產(chǎn)孔雀魚停食 24 h 后用Bouin’s液固定，11 h后放入70%乙醇中備用。將保存在70%乙醇溶液中備用的臨產(chǎn)孔雀魚取出，再用70%乙醇溶液沖洗4～5次，洗去殘色。叔丁醇逐級脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，厚度5～6 μm，蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片。采用Motic BA600-4數(shù)字切片掃描與應用系統(tǒng)高精度掃描切片并保存。之后用Motic數(shù)字切片助理Lite 1.0觀察組織，采集圖片。

2 結果與分析

2.1 消化系統(tǒng)

孔雀魚的口腔在胚胎后期階段已發(fā)育成型，產(chǎn)出后即能攝食，咽部有味蕾鑲嵌于黏膜表面(圖1-1，40×，TB表示味蕾)。胚胎后期階段孔雀魚的食道已經(jīng)形成，其管腔開通。黏膜向腔面褶成皺襞，皺襞之間為固有膜，黏膜表面襯裱著復層鱗狀上皮，在表層上皮之間有杯狀細胞，可分泌黏液；黏膜下層僅由疏松結締組織構成；肌層發(fā)達；漿膜為食道最外層，由薄層結締組織組成(圖1-2，20×，Mu表示肌層，LP表示固有膜，GC表示杯狀細胞)。孔雀魚在胚胎后期階段腸道已形成并形成腸腔，黏膜未向腸腔突起形成皺襞，黏膜表面襯裱著單層柱狀上皮，包含著吸收細胞和杯狀細胞2種細胞。吸收細胞數(shù)量較多，呈高柱狀，細胞核靠近細胞基部，細胞的游離面具有明顯的紋狀緣；杯狀細胞不明顯；固有膜及黏膜下層不明顯，肌層較薄；漿膜由間皮及一薄層結締組織構成，腸腔內(nèi)有分泌物質(zhì)(圖1-3，10×，Se表示漿膜；圖1-4，40×，CC表示柱狀細胞，SB表示紋狀緣)。孔雀魚在胚胎后期階段肝臟已形成，為一實質(zhì)性的器官。肝臟的最外面被疏松結締組織包裹，伸入肝實質(zhì)內(nèi)的結締組織很少，肝小葉的間隔不明顯；肝小葉中央有一血管為中央靜脈；肝細胞形態(tài)不明顯，僅見其細胞核呈圓球形，位于中央；肝血竇清晰，其形狀不規(guī)則(圖1-5，10×，HS表示肝血竇，CV表示中央靜脈)。孔雀魚的胰臟在胚胎后期階段已經(jīng)形成，分布復雜散亂，彌散于腸系膜上；胰腺腺泡上分泌物明顯(圖1-6，10×)。

2.2 呼吸系統(tǒng)

孔雀魚的鰓在胚胎后期階段已經(jīng)形成。有4片鰓，鰓弓明顯，由復層扁平上皮構成，內(nèi)有軟骨細胞，鰓弓下方有出鰓動脈和入鰓動脈2支血管平行排列，鰓弓和血管之間有結締組織填充；鰓弓一側為鰓耙，另一側為鰓絲固著其上，鰓絲另一端游離；鰓絲上的鰓小片發(fā)育不完善(圖1-7，10×，GA表示鰓弓，Gr表示鰓耙，→表示出鰓動脈，←表示入鰓動脈)。

孔雀魚的偽鰓在胚胎后期階段即已發(fā)育成型，毛細血管清晰；鰓片排列不如正常鰓片有序；鰓片中有許多小片，小片較密集；上皮細胞近于立方狀，其細胞核頗大，圓形，位于細胞邊緣(圖1-8，×40，BL表示鰓小片，EC表示上皮細胞)。

2.3 排泄器官

孔雀魚的頭腎在胚胎后期階段已經(jīng)形成，結構簡單，由腎主質(zhì)和腎間質(zhì)組成。腎主質(zhì)由前腎小管和腎小球構成，前腎小管由單層上皮細胞組成，腎小球由腎小囊內(nèi)的毛細血管盤曲而成；腎間質(zhì)含有豐富的造血細胞，具有造血功能(圖1-9，40×，RC表示腎小體，UT表示腎小管)。

孔雀魚的中腎在胚胎后期階段已經(jīng)發(fā)育成型，已經(jīng)具有排泄功能，由腎間質(zhì)與腎實質(zhì)組成。腎小管管壁為單層立方上皮，細胞游離端有刷狀緣(圖1-10，40×，UT表示腎小管)。腎小球發(fā)育完善，毛細血管壁較厚；腎小囊內(nèi)包裹著血管球，囊壁分臟層和壁層，臟層與壁層之間有一狹窄的腔隙，為囊腔，外壁由單層扁平細胞構成，孔雀魚在胚胎后期階段已形成脾臟，發(fā)育不完善，其紅髓和白髓清晰可見，但兩者分界明顯，各位于一側，不為紅白相間；脾臟表層為皮質(zhì)，內(nèi)部為髓質(zhì)，由大量紅血球及結締組織構成。(圖1-11，40×，RP表示紅髓，WP表示白髓)。

2.4 內(nèi)分泌器官

孔雀魚的胸腺在胚胎階段后期已經(jīng)形成，皮質(zhì)與髓質(zhì)清晰易辨，紅白髓相間；髓質(zhì)里淋巴細胞染色較深(圖1-12，40×，Co表示皮質(zhì)，Me表示髓質(zhì))。

孔雀魚的甲狀腺在胚胎后期階段已發(fā)育成型，為彌散性的，分布于腹主動脈和第Ⅰ至第Ⅲ鰓動脈周圍的鰓區(qū)間隙組織里，由甲狀腺腺泡組成，腺泡內(nèi)為嗜酸性染色的膠體，腺細胞核為圓形(圖1-13，40×，TG表示甲狀腺)。

孔雀魚的腦垂體在胚胎后期階段已發(fā)育成型，其上神經(jīng)部和腺垂體清晰可辨，與間腦相連，位于間腦的腹面(圖1-14，5×，HY表示腦垂體，Di表示間腦；圖1-15，40×，PN表示神經(jīng)部，Ad表示腺垂體，Di表示間腦)。

2.5 感覺器官

在胚胎后期階段，孔雀魚的嗅囊已發(fā)育成型。基細胞清晰，固有膜由結締組織構成，含有血管；支持細胞、杯狀細胞及嗅細胞形態(tài)不明顯，黏膜上皮的皺褶未形成。產(chǎn)出之后即具有感受食物所產(chǎn)生的化學刺激并尋找食物的作用(圖1-16，40×，BC表示基細胞，Ca表示毛細血管)。

孔雀魚在胚胎后期階段，眼睛已基本發(fā)育成型。晶體清晰，其實質(zhì)是由細長的晶狀體纖維組成；視網(wǎng)膜清晰，在視網(wǎng)膜與晶體間的后房內(nèi)存有大量的毛細血管；色素膜、脈絡膜、銀膜明顯；鞏膜內(nèi)有軟骨細胞分布；角膜由結締組織構成，虹膜內(nèi)含血管和色素細胞，分布于晶體的2側(圖1-17，8×，Le表示晶體，Re表示視網(wǎng)膜，Pi表示色素膜，Co表示角膜，Ir表示虹膜；圖1-18，20×，Sc表示鞏膜)。孔雀魚的內(nèi)耳在胚胎后期階段已發(fā)育成型，可見聽嵴、聽斑、感覺毛(圖1-19，20×，Ma表示聽斑，←表示感覺毛)。

2.6 心臟

孔雀魚的心臟在胚胎后期階段已發(fā)育完善，其心耳、心室已分化成型，心耳的壁較薄，心室的壁較厚，能進行血液循環(huán)(圖1-20，15×，At表示心耳，Ve表示心室)。

2.7 中樞神經(jīng)系統(tǒng)

孔雀魚的腦在胚胎后期階段已分化成型，端腦、間腦、中腦、小腦及延腦發(fā)育完善(圖1-21，4×，Me表示中腦，M表示延腦，SC表示脊髓，Te表示端腦)。胚胎后期階段，孔雀魚脊髓組織結構已發(fā)育完善，其灰質(zhì)區(qū)、白質(zhì)區(qū)清晰易辨(圖1-22，30×，WA表示白質(zhì)，GM表示灰質(zhì))孔雀魚在胚胎后期階段脊神經(jīng)節(jié)已發(fā)育成型，位于脊髓旁(圖1-22，30×，SG表示脊神經(jīng)節(jié)，SC表示脊髓，No表示脊索)。孔雀魚在胚胎后期階段皮膚發(fā)育完善但不明顯。頭部的皮膚含2層較薄的上皮細胞，真皮內(nèi)可見色素細胞，皮穴器官，僅有疏松層，未見膠原層(圖1-23，40×，Mel表示色素細胞，CO表示皮穴器官，)；軀干部皮膚未見疏松層；尾部皮膚可見色素細胞，表皮細胞為2層扁平細胞(圖1-24，40×，Mel表示色素細胞)。

3 結論與討論

3.1 性成熟與繁殖周期

本研究孔雀魚在養(yǎng)殖期所處水溫維持在29 ℃左右，從試驗孔雀魚剛從母體中產(chǎn)出至處于臨產(chǎn)狀態(tài)，共計96 d。張宇認為，孔雀魚屬于卵胎生魚類，直接產(chǎn)小魚，性成熟早，幼魚經(jīng)3—4個月飼養(yǎng)便進入成熟期，可以繁殖后代，性成熟遲早與水溫高低、飼養(yǎng)條件密切相關[1]。可見孔雀魚的性成熟周期隨著水溫的變動而有所不同。與試驗魚所處相同環(huán)境下的其他孔雀魚，其雌魚達到性成熟后繁殖周期為21 d，這與觀賞水產(chǎn)養(yǎng)殖學描述的繁殖周期30 d左右不相符[12]，可能與溫度高低有關。樓允東認為，在適溫范圍內(nèi)，提高水溫可引起胚胎提前出膜；不適宜的溫度能使胚胎的某些結構的發(fā)育特別加快或特別受到抑制而形成畸形發(fā)育[13]，本研究養(yǎng)殖孔雀魚在水溫為29 ℃左右時，產(chǎn)出的小魚中出現(xiàn)個別脊椎骨彎曲的情形。以成熟的雌魚為例，代謝速度過快，容易使魚體內(nèi)鈣質(zhì)加速流失，如果再加上產(chǎn)后失調(diào)，即有可能出現(xiàn)脊椎彎曲的情況，彎曲程度越大越容易壓迫內(nèi)臟，從而威脅孔雀魚的生存。

3.2 消化系統(tǒng)

孔雀魚胚胎后期食道已經(jīng)形成且有皺襞，有黏液細胞和杯狀細胞，細胞的分泌物能潤滑食物，有利于食物的運輸[14]。葉元土等認為，腸道對食物的消化和吸收主要與黏膜表面結構和腸道的分泌能力有關[15]。杯狀細胞能分泌黏液和消化酶，一方面對上皮起潤滑作用，另一方面與消化酶共同作用消化[14]。因此，杯狀細胞的多少可間接反映魚類的消化能力。孔雀魚胚胎后期杯狀細胞較少，腸腔內(nèi)表面紋狀緣清晰且腔內(nèi)含有吸收物，膽囊內(nèi)有膽汁分泌，可見孔雀魚胚胎后期已經(jīng)可以進行食物的攝取和消化。

硬骨魚類肝臟的形態(tài)因種而異。多數(shù)硬骨魚類肝臟分葉，少數(shù)魚類肝臟僅由單葉構成；肉食性硬骨魚類肝臟為實心腺體[16]，草食性或雜食性魚類其肝臟分散在腸系膜上，且混有胰腺組織。孔雀魚肝臟為實心腺體，體現(xiàn)了其雜食性魚類的特點。肝臟主要分泌膽汁，幫助消化脂肪。胰臟為彌散型，有少量胰臟組織伸入到肝臟中，大部分胰腺彌散于腸系膜中，胰腺細胞中有豐富的酶原顆粒。肝胰臟結構特點說明孔雀魚對食物分解代謝能力較強。

3.3 排泄器官

硬骨魚類的腎臟一般分為頭腎、中腎、后腎3個部分。硬骨魚類的頭腎是重要的免疫和造血器官，其功能類似哺乳動物的脊髓[17]，魚類抗菌、抗炎的免疫調(diào)節(jié)機制與哺乳動物類似，其在對虹鱒頭腎免疫機制研究中已得到驗證[18]。魚類頭腎在胚胎時期起源于前腎，具有泌尿功能，成體后因魚類物種不同，其組織結構及生理功能也存在較大差異，彈涂魚(Periophthalmuskoelreuteri)等魚類的頭腎中分布有許多與后腎一致的功能性腎單位結構[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)孔雀魚頭腎與中腎一致，都具有功能性腎單位結構。孔雀魚的頭腎也是機體重要的造血和免疫器官，且具有泌尿功能。

3.4 心臟

心臟的靜脈竇及動脈球均未發(fā)現(xiàn)，由于心耳、心室已發(fā)育完善，其靜脈竇及動脈球也已發(fā)育成型，可能為制片問題導致，試驗操作有待進一步改進。

3.5 眼睛

孔雀魚在胚胎發(fā)育早期，晶體與視網(wǎng)膜之間存在豐富的毛細血管，目前尚不清楚毛細血管的作用，有待進一步研究。

試驗孔雀魚在胚胎階段各個器官都已基本發(fā)育成型，仔魚產(chǎn)出后即能進行平游，且可以攝食。隨著仔魚的發(fā)育，其各器官組織形態(tài)與胚胎階段是否存在差異目前尚未有文獻報道，有待于進一步研究。