H9N2亞型禽流感可疑病料的病毒分離及初步鑒定

楊 婧， 劉宇卓， 劉青濤， 趙冬敏， 黃欣梅， 韓凱凱， 畢可然， 李 銀

(江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇南京 210014)

禽流感(avian influenza，簡稱AI)是由正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒屬A型流感病毒中任一亞型引起的家禽、野鳥和部分哺乳動物發病的一種傳染病[1-2]。高致病性禽流感會引起家禽高發病率及死亡率，而低致病性禽流感則會導致家禽出現呼吸道癥狀、生長發育受阻及產蛋下降等，嚴重危害養禽業的健康發展[3]。根據A型流感病毒表面糖蛋白血凝素蛋白(hemagglutinin，簡稱HA)和神經氨基酸酶(neuraminidase，簡稱NA)的抗原性不同，可分為不同的亞型，目前已發現18種HA亞型、11種NA亞型，其中H17N10、H18N11僅在蝙蝠中被分離鑒定[4-5]。根據禽流感的致病性不同又可分為高致病性禽流感(HPAI)、低致病性禽流感和無致病性禽流感[6]。由H5、H7亞型毒株引起的禽流感一般稱為高致病性禽流感，其發病率和病死率都很高，危害極大[7-8]，被世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties，簡稱OIE)列為必須報告的動物傳染病，我國將其列為一類傳染病，可見其對生物界的危害。而禽類中暴發的低致病性禽流感亞型主要為H5N2、H9N2亞型。

H9N2禽流感病毒呈世界性分布，按地區可分為北美和歐亞2個種系[9]。我國于1994年首次從雞體內分離出H9N2亞型禽流感病毒[10]，近些年來，我國每年均可分離到大量H9亞型禽流感病毒，臨床上感染雞的癥狀，常可見蛋雞產蛋下降、肉雞生長發育遲緩甚至死亡的現象，給養禽業造成較大的經濟損失。

自2004年以來，以H5N1亞型禽流感為代表的高致病性禽流感的暴發引起了我國政府和相關行政主管部門的高度重視，但與此同時，對低致病性禽流感主要是H9亞型的預防及控制卻被忽視了，養禽場(戶)對H9亞型低致病性禽流感疏于防范，對其認知程度和免疫接種理念較差，造成了H9亞型在全國范圍內的普遍流行及持續性危害。目前，H9亞型逐漸成為影響我國養禽業的主要禽流感病毒亞型，且對禽的危害越來越嚴重，可感染家禽并導致家禽產蛋量下降、免疫抑制病，與其他病原共感染時會導致家禽較高的死亡率，給我國養禽業造成了巨大的經濟損失。同時H9亞型禽流感病毒(AIV)可以感染人、豬等哺乳動物，在公共衛生上具有重要意義。

1998年在廣東省韶關市和汕頭市分別發現4例和5例H9N2禽流感病毒感染的病例[11]，為全球首次發現的人H9N2禽流感病毒感染病例。2013年2月在上海市出現了第1例人感染H7N9禽流感病毒的病例[12]，隨后該H7N9禽流感病毒席卷了我國大部分地區，對這次暴發的H7N9禽流感病毒進行溯源發現，它主要由4個不同來源的流感病毒重配而成，其內部基因則來源于存在于我國家禽中的H9N2亞型的流感病毒[13]。截至2017年1月31日，我國已確診的H7N9感染病例為1 069例，有410人死亡[14]。由此可見，H9N2亞型禽流感具有重要的公共衛生意義，值得引起公眾的注意。

本研究旨在初步分離并鑒定來自江蘇省某地區的可疑病料，用易感動物回歸試驗為禽類生產提供有效的診斷意見，以便及時診斷及免疫防控，從而減少禽流感H9亞型發生時所帶來的巨大經濟損失。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

病雞來源于江蘇省某地區養殖場。0.22 μm微孔濾膜過濾器(默克密理博有限公司)；生理鹽水，由筆者所在實驗室自制，pH值為6.8～7.0；1%雞紅細胞溶液，筆者所在實驗室自制，現用現配；9～11日齡無特定病原體(specific pathogen free，簡稱SPF)雞胚(南京天邦生物科技有限公司)；反轉錄酶(M-MLV)、RNase Out、10 mmol/L dNTP、5×buffer、10×PCR buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2、聚合酶(E×Taq)等(TaKaRa公司)；瓊脂糖(上海吉瑪制藥有限公司)；RNA/DNA提取試劑盒和膠回收試劑盒(康寧生命科學有限公司)；PCR儀、離心機(TaKaRa公司)；電泳儀(南京普陽科學儀器研究所)；全自動凝膠成像分析儀(JS-680B，上海培清科技有限公司)；高壓鍋(SY-450，徐州圣業醫療器械有限責任公司)；剪刀、鑷子、研缽(南京源奇頓生物科技有限公司)；打孔器、注射器(通州市張芝山鎮豐泰實驗器材經營部)；超凈工作臺(廣州佰倫超凈工作臺制造有限公司)；-70 ℃ 冰箱、-20 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 病理剖檢 主訴病雞癥狀：該養殖企業采用標準化雞舍飼養，使用全價料和自配料飼喂，近期陸續出現產蛋率下降、蛋殼褪色與變薄、少數病雞眼角分泌物增多、臉面腫脹、有輕度的呼吸啰音、精神沉郁、下痢、采食量下降等癥狀，個別病禽出現腹瀉，嚴重者食欲廢絕，飲水量增加，嗉囊中積有液體，雞群逐漸出現營養不良、消瘦等癥狀。發病初期飼養員以為是傳染性支氣管炎，采用磺胺類藥物治療，效果不明顯。

將病雞置于解剖臺，用75%乙醇消毒體表，分別用高壓后的手術剪、鑷子解剖，記錄各個臟器的眼觀癥狀。

1.2.2 病料處理 分別用高壓后的手術剪解剖，無菌采集3份病雞的心臟、肝臟、肺臟、小腸、喉頭、氣管、脾臟、腎臟等臟器，每份雞的上述臟器混合在一起研磨作為1個病料。置于高壓滅菌后的研缽中進行研磨，充分研磨后按體積比1 ∶3加無菌生理鹽水，置于-20 ℃冰箱中反復凍融3次。再次研磨后，8 000g離心5 min，取上清，用0.22 μm濾器過濾后，保存備用。

1.2.3 病毒RNA的提取 分別無菌取出“1.2.2”節中提到的樣品200 μL，置于高壓滅菌后的1.5 mL離心管中，按照RNA/DNA提取試劑盒說明書，加入200 μL蛋白去除液 V-L 試劑后，在渦旋振蕩儀上混勻，靜置5 min；加入75 μL V-N試劑，用渦旋振蕩儀混勻，12 000g離心5 min；取上清加在新的2 mL離心管中，再加入300 μL異丙醇(含無水乙醇)，上下倒置混勻，轉移至新的含有吸附柱的2 mL離心管中，6 000g離心 1 min；棄濾液，加入500 μL buffer W1(含無水乙醇)，12 000g離心1 min；棄濾液，加入800 μL buffer W2(含無水乙醇)，12 000g離心1 min；棄濾液，12 000g離心 1 min；將吸附柱置于新的1.5 mL離心管中，加入15 μL洗脫液TE試劑后，靜置1 min，12 000g離心1 min，即得到提取的總RNA和DNA。

1.2.4 病毒RNA的反轉錄(RT)和PCR擴增 反轉錄體系：12 μL RNA、2 μL 10 mmol/L dNTP、4 μL 5×buffer、1 μL Unit 12、1 μL M-MLV、0.5 μL RNase Out。反轉錄程序：65 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，98 ℃ 5 min。

PCR擴增體系：2.75 μL cDNA、2.00 μL 2.50 mmol/L dNTP、2.50 μL 10×Buffer、14.00 μL ddH2O、1.50 μL 25 mmol/L MgCl2、0.25 μL E×Taq、1.00 μL上游引物P1、1.00 μL下游引物P2。PCR擴增引物：禽白血病(ALV)特異引物、雞傳染性貧血(CAV)特異引物、雞網狀內皮組織增殖病(REV)特異引物、H9 AIV特異引物、H5 AIV特異引物、新城疫(ND)特異引物、雞傳染性支氣管炎(IB)特異引物。PCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；-72 ℃ 10 min。

1.2.5 電泳和核酸膠純化及測序 配制1%瓊脂糖凝膠，進行電泳。調節電泳儀為穩壓模式，于80 V下電泳30 min。將陽性條帶切下后，用膠回收試劑盒純化陽性條帶，并送公司測序。

在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，稱質量后作為1個凝膠體積，加入3倍凝膠體積的buffer DE-A，混合均勻后于75 ℃加熱，2～3 min混合1次，直至凝膠塊完全熔化；加入0.5倍buffer DE-A體積的buffer DE-B，混合均勻；將此混合液轉移到放置了DNA制備管的2 mL離心管中，12 000g離心1 min，棄濾液；將制備管重新置于2 mL離心管中，加入500 μL buffer W1(含無水乙醇)，12 000g離心30 s，棄濾液；將制備管重新置于2 mL離心管中，加入700 μL buffer W2(含無水乙醇)，12 000g離心30 s，棄濾液；用 700 μL buffer W2(含無水乙醇)于12 000g離心1 min，棄濾液；將制備管重新置于2 mL離心管中，12 000g離心1 min；將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備膜中央加 25 μL ddH2O，室溫靜置1 min，12 000g離心1 min洗脫DNA。

1.2.6 基因的序列拼接及Blast 用DNAStar軟件中的Seqman拼接得到基因序列，然后用美國國立生物技術信息中心(NCBI)的在線Blast系統比對序列。

1.2.7 病毒擴增 取用經0.22 μm濾器過濾后的病毒上清，每個雞胚接種0.2 mL，尿囊腔接種9～11日齡無特定病原體動物(SPF)雞胚，收集24 h后自然死亡的雞的胚尿囊液，放置于-70 ℃保存備用。

1.2.8 易感動物回歸試驗 將擴增后的病毒尿囊液用無菌生理鹽水稀釋1 000倍，接種健康1月齡SPF雞5羽，每羽滴鼻注射100 μL，同時以3羽同批次的健康SPF雞作為空白對照，每羽滴鼻注射100 μL無菌生理鹽水，觀察并記錄雞的發病情況。于攻毒后3 d采集喉頭、泄殖腔拭子，攻毒后7 d采集翅靜脈鮮血，并于雞發病后解剖，觀察其病理變化。

1.2.9 血凝試驗(HA試驗)和血凝抑制試驗(HI試驗) 將攻毒后3 d采集的喉頭、泄殖腔拭子，于-20 ℃反復凍融2次后取出，室溫融化后，用吸水紙擦干拭子管壁，用渦旋振蕩器混勻后，于4 ℃、3 000g離心5 min。將離心后的拭子置于冰盒中保存備用。

分別取喉頭、泄殖腔拭子的上清接種9～11日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，每個樣品接種3枚SPF雞胚，尿囊腔接種，收集24～72 h后自然死亡的雞胚尿囊液，并用血凝試驗檢測其血凝價，收取最高血凝價雞胚的尿囊液作為后續測序用的病毒液。

將攻毒后7 d采集的翅靜脈鮮血于5 000g離心5 min，取上清，并將筆者所在實驗室已有標準抗原H5、H9、ND按照國標GB/T 14926.54—2001《實驗動物 血凝抑制試驗》配制成4單位抗原，進行血凝抑制試驗。

1.2.10 再次測序及進行序列比對分析 將收取最高血凝價雞胚的尿囊液作為后續測序的病毒液，按照“2.3～2.6”節方法進行病毒的測序及序列比對分析。

2 結果與分析

2.1 病理剖檢

剖檢前可見病雞尸體消瘦，臉部蒼白，羽毛松亂，腿爪干燥缺乏彈性，皮下瘀血，肌肉呈紫色。臉部腫脹者見皮下有白色或淡黃色膠凍樣物浸潤。剖檢時發現病雞肝臟充血；心包膜擴張，心包液混濁，心外膜附有大量呈絨毛樣的纖維狀物；脾臟腫脹，呈暗紫色，表面有出血點；喉頭、氣管充血、出血明顯，氣管有干酪樣阻塞，腹膜混濁。具體剖檢結果見圖1。

2.2 病毒PCR擴增后電泳結果

3個樣品分別用ALV特異引物、CAV特異引物、REV特異引物、H9特異引物、H5特異引物、ND特異引物、IB特異引物進行PCR擴增后，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。

由圖2可知，病料2、3的H9擴增結果均為陽性，其中病料3的陽性帶稍亮，對其切膠回收進行測序。病毒的易感動物回歸試驗均以病料3作為病毒來源。

2.3 基因序列拼接及Blast結果

用DNAStar軟件中的Seqman拼接所得基因序列見圖3，然后用NCBI的在線Blast系統比對序列，結果見圖4。由序列分析及Blast分析結果可知，該病毒為H9N2亞型禽流感病毒。

2.4 易感動物回歸試驗

將擴增后的病毒尿囊液，用無菌生理鹽水稀釋1 000倍，接種健康1月齡SPF雞，每羽雞滴鼻注射100 μL。攻毒后雞精神沉郁，攻毒后3 d時有稀便排出，偶有血絲；有輕度的呼吸急促癥狀。攻毒后5 d時沒再發現稀便，飲水量增加，未見明顯的采食量下降和體質量減輕。攻毒后7 d時基本未見其他臨床癥狀。本次動物試驗均無雞死亡。

2.5 血凝試驗和血凝抑制試驗結果

把攻毒后3 d采集的攻毒組5只雞和對照組3只雞的喉頭、泄殖腔拭子分別接種9～11日齡SPF雞胚，每個樣品各接種3枚SPF雞胚，收取尿囊液后得出的血凝試驗，血凝結果見表1。

用筆者所在實驗室已有的標準抗原H5亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫ND病毒對攻毒后7 d采集的血清按照GB/T 18936—2003《高致病性禽流感診斷技術》進行血凝抑制試驗，血凝抑制結果見表2。

2.6 再次測序及序列比對分析

將收取最高血凝價(29)雞胚的尿囊液作為后續測序的病毒液， 按照“2.3～2.6”節方法進行病毒的測序及序列比對分析，測序結果見圖5。

表1 攻毒后3 d喉頭、泄殖腔拭子接胚后的HA試驗結果

表2 攻毒后7 d血清的HI試驗結果

前后2次的測序結果用DNAStar軟件中的MegAlign進行對比，分析結果見圖6。由比對結果可知，前后2個病毒的同源性為99.9%，表明在易感動物回歸試驗中，該病毒未發生變化，前后一致。

3 討論

H9N2亞型禽流感病毒可引起雞群的呼吸道癥狀、產蛋下降并可提高其他病原的易感性。由于其致病性低，雞感染后往往不易察覺。當存在不同的禽流感病毒共感染時，H9N2亞型禽流感病毒可以作為流感病毒基因傳播的載體，提高禽流感病毒持續存在和發生變異的概率[15]。Guo于1998年7—8月從有類似流感癥狀的病人體內分離了5株H9N2，于1999年11月從另一名廣東兒童體內分離到了H9N2病毒，由此可見其對公共衛生安全的影響不容小覷[16]。在本研究中，通過對H9N2亞型禽流感可疑病料的病毒分離、RNA提取和PCR基因擴增及基因測序等，證明出該可疑病料中確實含有H9N2亞型禽流感病毒，該方法操作簡單，特異性較高，靈敏性較強，能快速檢測出H9N2亞型禽流感病毒，是鑒定或檢測流感病毒較為推薦的檢測方法。

家禽感染H9N2亞型禽流感病毒一般有咳嗽、打噴嚏、啰音、喘鳴等呼吸系統癥狀，下痢和產蛋突然下降，輕微病變可見鼻的卡他性、纖維素性、漿液性或干酪樣炎癥，氣管黏膜水腫，且有漿液性到干酪樣的滲出物，氣囊可能增厚，有纖維素性或干酪樣滲出物，或者卡他性到纖維性腹膜炎和蛋性腹膜炎。在火雞上多能見到盲腸炎和/或腸道的卡他性到纖維素性腸炎，產蛋禽的輸卵管可能有滲出物[17]。在本研究中，將所研磨的病料用0.22 μm濾器過濾后，接種9～11日齡SPF雞胚，收集尿囊液，進行易感動物回歸試驗時發現，攻毒后雞雖有精神沉郁，排出稀便，間雜著血絲及有輕度的呼吸急促癥狀，但未見明顯的采食量下降和體質量減輕，而且本動物回歸試驗中均無雞死亡。這與臨床生產不符，可能是因為生產中的雞還感染了其他病原，與H9N2亞型禽流感病毒共感染時，加劇降低機體免疫力，同時增強其他病原的致病性[18]，從而導致實際生產中發生雞死亡現象。

禽流感的早期診斷對于控制疫情具有重要的意義，一般通過病禽的流行病學、臨床癥狀、病理變化可作出禽流感的初步判斷[19]，但若須準確診斷，則須要檢測禽流感病毒的抗原、基因或者分離鑒定病毒。目前對于禽流感的診斷主要有檢測禽流感抗原，方法有血凝試驗和血凝抑制試驗、抗原捕捉酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)、熒光抗體和免疫酶組化法等[20]，檢測禽流感基因的方法主要有逆轉錄PCR(RT-PCR)法和標記核酸探針原位雜交法，其中，尤以RT-PCR法較為敏感和特異。

此外，在生產中，應加強飼養管理，這是最根本的措施，是預防傳染病的最好方式。應提供營養全價平衡的飼料，以增強禽體的體質。另外，應做好管理工作，每個禽場根據自己的具體情況來制定管理方案。認真執行各項隔離制度，防止傳染源的傳入與傳播；定期消毒，降低環境中病毒的含量。一般對禽舍內外環境1周進行2次消毒。家禽場實施全進全出的飼養管理制度，避免各種日齡的家禽混養。建立有效的監測系統，及早發現有異常表現的禽類。一旦發生應立即通報，并果斷采取隔離、封鎖、撲殺等迅速切斷傳播途徑的方法防止病毒的擴散。