蒙古蒿揮發油的化學組分及其抑菌活性分析

智亞楠， 陳月華， 溫亞娟， 馬宇明， 陳利軍， 尹 健

(1.信陽農林學院，河南信陽 464000； 2.豫南植物有害生物綠色防控院士工作站，河南信陽 464000)

近年來，從植物中尋找殺菌活性物質是目前農藥研究領域的熱點，植物揮發油是研究對象之一。植物揮發油是存在于植物組織中的一類重要的次生代謝物質，由分子量較小的簡單化合物組成，常溫下多為油狀液體，易揮發，具有特征性氣味[1]。多項研究表明揮發油具有明顯的抗植物病原真菌、細菌的功能[2-9]。國外已有以揮發油為活性成分的殺菌劑商品問世[10-11]。揮發油的抗菌活性與揮發油的官能團等化學結構密切相關[12-13]，因此研究揮發油的化學組分及活性對殺菌劑的開發有一定的啟迪作用。

蒙古蒿[Artemisiamongolica(Fisch.ex Bess.) Nakai]為菊科蒿屬多年生草本植物，多生于中或低海拔地區的山坡、灌叢、河湖岸邊及路旁等。分布在我國東北、華北和西北各省區，在河南省信陽市為常見野生植物。蒙古蒿可全草入藥，有溫經、止血、散寒、祛濕等作用[14]。蒙古蒿全草含有豐富的揮發油，目前已有學者對蒙古蒿揮發油化學組分和活性進行了研究。1983年師治賢等就對采自青海省的蒙古蒿揮發油的化學成分進行了報道，報道中鑒定了50余種化合物，包括α-蒎烯、β-蒎烯、γ-松油烯、樟腦等，但未明確每種化合物的含量[15]。董巖等采用二氧化碳超臨界流體萃取法提取采自山東省德州市蒙古蒿中的揮發油，并研究了揮發油對幾種細菌的抑制活性，經鑒定其主要成分為桉樹腦、α-蒎烯、大根香葉烯D等[16]。Liu等報道了蒙古蒿精油的主要成分是α- 蒎烯、大牛兒烯D和萜品烯等，并測定了其對玉米象的熏蒸殺蟲活性和觸殺活性[17]。

為了掌握河南信陽蒙古蒿揮發油的組分及抑菌活性，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取蒙古蒿中的揮發油，用氣質聯用儀(GC-MS)分析其化學組分，并以水稻胡麻斑病菌(Bipolarisoryzae)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)4種常見植物病原菌為目標菌，測定揮發油對病原菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，為蒙古蒿在農業上的開發和利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蒙古蒿 蒙古蒿全草于2016年6月采自信陽農林學院桃李園山坡，經信陽農林學院周巍高級實驗師鑒定為蒙古蒿(Artemisiamongolica)，采集健康、生長力旺盛的植株帶至實驗室，剪成小于1 cm的小段。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、瓊脂17 g、水1 000 mL。

1.1.3 植物病原真菌 水稻胡麻斑病菌、水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌、辣椒炭疽病菌均由信陽農林學院植物病理實驗室分離保存。

1.1.4 主要儀器與設備 Agilent 6850/5975氣質聯用儀(購自美國安捷倫公司)；NIST14譜庫、HP-250S生化培養箱(購自武漢瑞華儀器設備有限責任公司)；KDM-2000 電熱套(購自金壇市恒豐儀器制造有限公司)等。

1.2 蒙古蒿揮發油的提取

稱取新鮮蒙古蒿植株小段，裝入圓底燒瓶中，采用水蒸氣蒸餾法，連續提取4 h，得到具有特殊濃郁氣味的深藍色油狀液體，即為蒙古蒿揮發油。將揮發油密封好，4 ℃冰箱保存備用。重復3次。

1.3 揮發油熏蒸抑制作用測定

蒙古蒿揮發油對植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用采用生長速率法[4]測定。在直徑90 mm的培養皿中加入 15 mL 融化的培養基，搖勻制成厚薄均勻平板，平板中央接種1塊植物病原真菌菌餅。然后在皿蓋上放置已滅菌的圓形濾紙片，吸取一定劑量的揮發油滴加到濾紙片上。對不同的植物病原菌，根據抑菌預試驗結果，設置不同的揮發油劑量梯度，以僅放濾紙片不滴加揮發油為對照。72 h后觀察植物病原真菌的生長情況，并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率。

抑菌率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/對照菌落生長直徑×100%；

利用SPSS17.0統計分析軟件繪制標準曲線，建立毒力回歸方程，并求得相關系數和有效中濃度(EC50)，并根據EC50來比較揮發油對不同病原真菌的毒力。

1.4 揮發油GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 ms毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫，初始柱溫為60 ℃，保持 2 min，以10 ℃/min升溫速率升至230 ℃，保持1 min；載氣為高純氦氣，流速為1.0 mL/min，進樣量為1.0 μL，不分流，進樣前揮發油用乙醚適當稀釋。質譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，掃描范圍33～350 amu。

2 結果與分析

2.1 蒙古蒿揮發油組分GC-MS分析

利用GC-MS對蒙古蒿揮發油組分進行分析，總離子流量如圖1所示。利用色譜峰面積歸一法測得各組分的相對含量，所得質譜圖經NIST14質譜數據庫檢索，與標準圖譜核對，并結合化學物質登錄號(CAS號)分析，從蒙古蒿揮發油中共分離到33個組分，鑒定出了其中的29個組分(表1)，占揮發油總量的95.602%。

從表1可看出，蒙古蒿揮發油中相對含量最高的組分為蘭香油薁(16.59%)，其次為大根香葉烯D(14.916%)，再次為石竹烯(9.615%)、桉樹腦(8.782%)和順式-菊烯醇(6.014%)等。在鑒定出的29種化合物中，以萜類化合物為主，其中倍半萜類化合物14種，占揮發油總量的43.381%；其次是單萜類化合物9種，占揮發油總量的31.381%；薁類化合2種，占揮發油總量的17.115%，另外還有酯類等化合物。

2.3 蒙古蒿揮發油對植物病原真菌的熏蒸抑制作用

用生長速率法測定蒙古蒿揮發油對4種植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用，測定結果見圖2、表2。由表2可知，蒙古蒿揮發油對供試病原菌均有一定的熏蒸抑制作用，試驗劑量范圍內抑制作用隨揮發油劑量增加而增強。在5.0 μL/皿劑量下，揮發油對水稻紋枯病菌的抑制率最高，達到 60.42%，對水稻胡麻葉斑病菌的抑菌率最低，為29.02%。在10.0 μL/皿劑量下，揮發油對水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制作用較明顯，抑菌率分別為73.45%和71.77%。在12.0 μL/皿劑量下揮發油對水稻紋枯病菌、小麥赤霉病菌和辣椒炭疽病菌的抑制率均達到75%以上，而水稻胡麻斑病菌要在劑量為15.0 μL/皿下，抑制率才能達到73.71%。

表1 蒙古蒿揮發油的化學組分分析

表2 蒙古蒿揮發油對4種植物病原真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用

蒙古蒿揮發油對植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結果見表3。從EC50分析可知，蒙古蒿揮發油對水稻紋枯病菌的抑制作用最強，EC50僅為3.05 μL/皿，其次是小麥赤霉病菌，EC50為5.20 μL/皿，揮發油對辣椒炭疽病菌的抑制作用相對較弱，EC50為6.98 μL/皿，對水稻胡麻斑病菌的抑制作用最弱，EC50為9.01 μL/皿。

表3 蒙古蒿揮發油對4種植物病原真菌菌絲生長的毒力測定結果

3 結論與討論

本研究通過水蒸氣蒸餾法提取蒙古蒿的揮發油，采用 GC-MS 對蒙古蒿揮發油化學組分進行分離鑒定，主要組分為蘭香油薁(16.590%)、大根香葉烯D(14.916%)、石竹烯(9.615%)、桉樹腦(8.782%)和順式-菊烯醇(6.014%)等。與青海[15]、山東[16]等地產蒙古蒿揮發油的主要化學組分有所不同，主要區別在于本研究鑒定出的含量最高的成分蘭香油薁在其他蒙古蒿揮發油的研究中未見報道。這些區別可能與試驗材料的生境、采收時間、前處理方式有關。蘭香油薁主要存在于甘菊、白蒿等植物中，具有抗炎、抗過敏的作用[18-21]。蘭香油薁為藍色黏稠液體，難溶于水[18]，本研究提取的揮發油即為深藍色，推測是蘭香油薁顏色的體現。其他主要成分中大根香葉烯D[22-23]和桉樹腦[24]具有顯著的抑菌活性，石竹烯[25]對棉蚜有毒殺活性。

本研究發現，信陽野生的蒙古蒿揮發油對供試的4種植物病原真菌均有強烈的熏蒸抑制作用，對水稻紋枯病病菌、小麥赤霉病病菌、辣椒炭疽病病菌和水稻胡麻斑病病菌4種真菌菌絲生長的熏蒸抑制作用的EC50介于3.05～9.01 μL/皿之間，其中對水稻紋枯病病菌和小麥赤霉病病菌的抑制作用最強，EC50僅為3.05和5.20 μL/皿。因此，利用蒙古蒿揮發油明顯的抑菌作用有望研發出熏蒸劑應用于植物病害防控。本試驗僅是對蒙古蒿揮發油的抗菌活性做了初步的研究，由于其化學成分的復雜多樣性，有關蒙古蒿揮發油抗植物病原真菌的活性機制、組分間互作及其他生物活性試驗有待進一步研究。

前人研究表明，多種蒿屬植物均具有廣譜的抗菌、殺蟲作用[1，5，26-30]，例如黃花蒿、艾蒿、茵陳蒿、大籽蒿、白草蒿、銀葉艾蒿等；本研究的試驗材料蒙古蒿也被證實其溶劑粗提物對舞毒蛾具有毒殺活性[30]；其精油浸膏有驅蚊活性[31]；其乙醇提取物對丁香假單胞菌、根癌土壤桿菌、馬鈴薯環腐病菌具有一定的抑制活性[26]。隨著對蒿屬植物研究的不斷深入，一些新的技術和手段不斷應用于這一領域，隨著其有效成分提取和分析檢測技術的提高，蒿屬植物的開發利用將擁有廣闊的前景。