有機肥不同施肥量對茶園土壤微生物區系的影響

趙曉楠， 李玉紅， 蘆阿虔， 王 巖

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州 450001)

茶樹是多年生經濟作物，喜酸聚鋁，因此茶園土壤比較特殊。為了提高茶葉產量，茶農長期大量使用化肥，導致茶園土壤綜合肥力下降，茶園土壤生態遭到破壞。土壤是茶樹生長發育、營養吸收的重要場所，是一個非常復雜的生態系統。施肥是影響土壤質量及其可持續發展最重要的農業措施之一，在農業生產實踐中，施肥技術在土壤肥力、土壤微生物及作物產量和品質方面具有非常重要的影響，而土壤微生物在促進土壤有機質分解、土壤礦質營養循環、維持和提高土壤肥力等方面發揮著關鍵作用[1]。20世紀90年代以來，關于不同施肥方式對土壤生態系統的影響已有多人進行研究，但是前人對茶園土壤微生物的研究，受研究技術手段所限，大多數僅限于實驗室可培養微生物，基于分子生物學的研究尚不多見。由于環境中的微生物只有1%可用傳統平板計數法進行分離培養[2-3]，勢必會低估土壤微生物的群落結構組成，無法對土壤微生物群落結構及組成進行全面精準的分析。隨著分子生物學技術的發展，基于分子生物學的土壤微生物的研究方法，如高通量測序技術解決了微生物不可培養的問題，能夠準確地反映土壤微生物群落的豐度和多樣性。因此，研究不同施肥制度下茶園土壤微生物區系的特征，可為茶園合理施肥和營造良好的茶樹生長環境提供理論支撐。

河南省信陽市是歷史名茶信陽毛尖的產地，其茶葉種植面積較大，但在茶葉生產過程中同樣存在片面追求產量而忽視土壤質量的問題。鑒于此，筆者在河南省信陽市浉河區浉河港鎮的茶園進行大田試驗，研究有機肥不同施用量對茶園土壤性質和土壤微生物區系的影響，以期通過合理的施肥措施，實現信陽市茶產業生態、可持續發展。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

選取位于河南省信陽市浉河區浉河港鎮林場村八里坡組的茶園進行大田試驗，供試茶園的生境狀況如下：茶樹品種為福建大白茶7號，樹齡為16年，地理位置為32.026°N、113.849°E，面積為0.5 hm2，海拔為284.3 m，坡向為東坡，坡度為25°，前作為林地。分別于2012年12月、2013年12月和2014年12月進行有機肥表面撒施，茶園按當地習慣進行田間管理，于每年清明節前采取土壤樣品進行相關測定。試驗設置3個處理：不施肥(CK)、施有機肥1 500 kg/hm2(T1)和施有機肥3 000 kg/hm2(T2)。試驗用有機肥養分含量標準：有機質>45%，N+P2O5+K2O>7%。

1.2 樣品采集

連續施用有機肥3年后，采用五點取樣法對各處理試驗田進行土壤樣品采集。取0～20 cm土層的土壤，剔除土樣中較大的根和石子等雜物，之后將土樣中較大的土塊捏碎，混合均勻，然后采用四分法，將一部分裝入15 mL離心管中冷藏，用于土壤微生物分析；另一部分于托盤中自然風干后磨細，過18、80目篩，用于土壤養分含量的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤養分含量測定方法 土壤pH值的測定采用SPM-10數字式pH計測定，堿解氮含量的測定采用堿解擴散法，土壤速效磷含量的測定采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法，土壤速效鉀含量的測定采用乙酸銨提取-火焰光度法，土壤有機質含量的測定采用重鉻酸鉀-油浴法[4]。

1.3.2 土壤微生物區系測定 土壤微生物區系采用高通量測序技術[5-6]，細菌以16S rDNA作為標記基因，真菌以18S rDNA作為標記基因，測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行。

2 結果與分析

2.1 不同處理對茶園土壤養分含量的影響

從表1可以看出，施用有機肥可以提高土壤中有機質、全氮、堿解氮和速效鉀含量，對土壤pH值和速效磷含量的影響不大。

表1 供試茶園的土壤養分含量

2.2 不同處理對茶園土壤微生物群落結構組分的影響

2.2.1 不同處理對茶園土壤細菌群落結構組分的影響 從圖1中不同處理茶園土壤細菌群落結構組分分析結果可以看出，不同處理茶園土壤所含細菌屬的種類和數量均發生了變化。從對照土樣中共檢測出441個細菌屬，總數是14 944個；從T1處理土樣中共檢測到493個細菌屬，總數是8 529個；從T2處理土樣中共檢測到535個細菌屬，總數是9 672個。隨著有機肥施用量的增加，檢測出的細菌屬的種類增加。

在檢測出的所有細菌屬中，除去未檢測到的和未命名的，將各處理細菌屬含量排名前10的列出。由表2可知，不同處理的茶園土壤中優勢細菌屬的種類和數量均有差異，其中數量達到總數2%以上的細菌屬，對照有6種，分別為Gp1、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas)、Gp3、Gp6、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)和生絲微菌屬(Rhizomicrobium)；T1處理中數量達到總數2%以上的有10個屬，分別為沙雷氏菌屬(Serratia)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、食酸菌屬(Acidovorax)、綠膿桿菌(Pseudomonas)、發光細菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)、戴爾福特菌屬(Delftia)、Gp4、鐵桿菌屬(Ferruginibacter)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)；T2處理土壤中數量達到總數2%以上的有7個屬，分別為假單胞菌屬(Pseudomonas)、Gp4、Gp1、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、黃色桿菌屬(Xanthobacter)、發光細菌屬(Spartobacteria_genera_incertae_sedis)和芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表2 不同處理土壤中優勢細菌屬含量及占比

由表2還可以看出，不同處理茶園土壤優勢菌屬種類及其占比均發生了變化。與對照相比，施用有機肥數量增加的細菌有芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、發光菌屬和黃色桿菌屬等。其中，乳酸桿菌屬于厭氧性微生物，關于乳酸桿菌的應用在畜牧業和醫學上已有很多人進行研究[7-8]，但是其在農業方面的應用研究很少。發光細菌是一種在正常的生理條件下能夠發射可見熒光的細菌，發光細菌及其發光基因在環境監測等領域中具有廣泛的應用價值，可以用來檢測土壤毒性[9-11]。黃色桿菌屬對農田中的對鱗翅目害蟲有很好的防治作用，可用來殺死菜青蟲[12]。至于茶園土壤中這些細菌的功能和作用到底是什么尚不得而知，須要進一步探討與研究。

2.2.2 不同處理對茶園土壤真菌群落結構組分的影響 從圖2的不同處理對茶園土壤真菌的群落結構組分的影響可以看出，不同施肥處理的茶園土壤所含真菌屬的種類和數量均發生了變化，其中從對照中檢測出47個真菌屬，總數是5 687個；從T1處理中檢測到64個真菌屬，總數是86 112個；從T2處理檢測到70個真菌屬，總數是11 736個。

在檢測出的所有真菌屬中，除去未檢測到的和未命名的，將各處理真菌屬數量排名前10的列出，由表3可以看出，占比達到2%以上的真菌屬數量作為優勢菌屬，對照中優勢真菌屬有4種，分別為粗糙孔菌屬(Trechispora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)；T1處理有8種，分別為接合菌綱未命名屬(unclassified Zygomycota)、鐮刀菌屬(Fusarium)、隱球菌屬(Cryptococcus)、被孢霉屬(Mortierella)、原金蝗屬(Gongronella)、糙孢孔目-未命名屬(unclassified Trechisporales)、紅酵母(Rhodotorula)和Umbelopsis；T2處理有8種，分別為隱球菌屬(Cryptococcus)、糙孢孔目未命名屬(Unclassified Trechisporales)、鐮刀菌屬(Fusarium)、紅酵母(Rhodotorula)、皮司霉屬(Guehomyces)、Adisciso、被孢霉屬(Mortierella)和Mrakia。

從表3還可看出，不同處理下茶園土壤的優勢真菌屬種類及其占比均發生了變化。與對照相比，施用有機肥后數量增加的真菌主要有鐮刀菌屬、隱球菌屬和被孢霉屬等，從T1、T2處理中均檢測到了紅酵母。有研究表明，鐮刀菌屬廣泛分布于自然界中，能產生植物刺激素(赤霉素)，可使農作物增產，同時也是一類重要的植物病原菌，能引起許多植物病害，如由禾谷鐮刀菌為病原的小麥赤霉病是寧夏小麥的常發性病害[13]；然而，鐮刀菌在植物線蟲防治方面卻有重要作用，而且非致病性鐮刀菌還可用來防治鐮刀菌病害。壺菌門是高等植物的寄生蟲，雖然對植物生長的直接影響不大，但是其游動孢子是傳播土壤中一些病毒的介體，研究發現，壺菌門的玉蜀黍節壺菌能引起玉米褐斑病，內生集壺菌能引起馬鈴薯癌腫病，因此，該菌的減少有助于土壤環境的改善。紅酵母是一種腐生菌，可分解多種物質，是天然的清潔工[14]。然而，這些茶園土壤中的優勢真菌到底有什么樣的功能尚不清楚，如何篩選出具有促生型或抗病型功能的有益菌值得進一步研究。

表3 不同處理優勢真菌屬含量及其占比

2.3 不同處理對茶園土壤生物多樣性的影響

α多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，計算群落分布豐度(community richness)的指數有Chao指數、ACE指數，這2個指數用來估計群落中OTU(操作分類單元)數。用Shannon指數來計算群落分布多樣性(community diversity)，Shannon值越大，說明群落的多樣性越高。用各樣品文庫的覆蓋率可以反映測序結果的真實情況。

由表4不同處理對茶園土壤細菌多樣性的影響結果可知，在97%分類水平下，不同施肥處理下微生物OTU數量、Chao指數、ACE指數和Shannon指數有所差異。Chao指數的大小順序為T2>CK>T1；ACE指數的大小順序為T2>CK>T1；Shannon指數的大小順序為CK>T2>T1。由此可見，施用有機肥可提高茶園土壤細菌的豐度，但并未提高細菌群落的多樣性。

由不同施肥處理對茶園土壤真菌多樣性的影響(表5)可知，Chao指數表現為T2>CK>T1，ACE指數表現為T2>CK>T1，Shannon指數表現為T2>T1>CK。以上結果表明，有機肥的施入并不一定會提高真菌的豐度，但對于豐富土壤真菌的多樣性是有利的。

3 討論與結論

目前，高通量測序方法已經成為研究不同地區土壤微生物群落結構及組成的主要方法。劉洋等分析了基于454高通量測序的黃土高原不同喬木林土壤細菌群落特征，結果表明，

表4 不同處理對茶園土壤細菌多樣性的影響

表5 不同處理對茶園土壤真菌多樣性的影響

不同喬木林土壤中的優勢菌來自變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)，主要優勢菌綱為放線桿菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alphaproteobacte ria)、酸桿菌(Acidobacteria)、β-變形菌綱(Betaproteo bacteria)、浮霉菌綱(Planctomycetacia)[15]。汪其同等基于高通量測序分析了楊樹人工林根際和非根際細菌群落結構的不同，發現根際和非根際相對豐度>4%的屬有8個，分別是Acidobacterium、Gp1、Acidobacterium、Gp3、Acidobacterium、Gp6、Gemmatimonas、Bradyrhizobium、Burkholderia、Streptomyces和AcidobacteriumGp4[16]。α多樣性分析表明，根際土壤細菌群落多樣性高于非根際土壤，但差異未達到顯著水平。

施用有機肥對土壤微生物的影響已有很多研究，朱慶松等分析了不同覆蓋措施對信陽毛尖茶園土壤微生物量動態變化的影響，結果表明，稻草覆蓋處理與白三葉覆蓋處理均能增加土壤微生物的數量和活性[17]。朱海平等通過分析不同培肥管理措施對土壤微生物生態特征的影響發現，施入廄肥、化肥或秸桿還田均能明顯增加土壤微生物生物量及呼吸量[18]。林新堅等研究表明，施用有機肥可有效改善土壤物理性狀，增加土壤微生物總量[19]。王鵬研究發現，有機生物活性肥料能夠促進土壤中有益微生物的繁衍，有效提高土壤酶生物活性[20]。單武雄等發現，施用菜籽餅肥加稻草覆蓋處理可以顯著提高0～20 cm土層的蚯蚓數量和生物量、氨氧化細菌、好氣性自生固氮菌、嫌氣性自生固氮菌、放線菌、真菌和細菌等物生物數量[21]。溫延臣等研究發現，施用有機肥以及有機無機配肥與化肥相比，土壤微生物碳、氮含量分別增加50%～112%、34%～79%，提高了土壤活性養分供應能力[22]。總體來說，施用有機肥可以增加土壤中微生物的數量，但是目前基于高通量測序的方法對土壤微生物群落結構和生物多樣性的研究尚不多見。

因此，本試驗運用Miseq測序平臺研究了有機肥施用量對茶園土壤微生物群落結構和生物多樣性的影響，結果表明，增施有機肥可以改變茶園土壤微生物的OTU數量和種類，且隨著施肥量增加，茶園土壤微生物的OTU豐度越高。不同施肥處理的茶園土壤所含微生物屬的種類和數量都有所差異，隨著有機肥施用量的加大，可檢測出的細菌和真菌屬的種類也變多。