鐵皮石斛內生真菌誘導子制備及其可溶性糖含量測定

朱 波， 齊 川， 斯金平， 吳令上

(1.麗水市農業科學研究院，浙江麗水 323000； 2.浙江農林大學亞熱帶森林培育國家重點實驗室，浙江臨安 311300；3.麗水市中藥材產業發展中心，浙江麗水 323000)

鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)是我國傳統名貴中藥材，具有益胃生津、滋陰清熱等功效，用于熱病津傷、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔等癥，位列中華九大仙草之首[1-2]。現代藥理學研究表明，鐵皮石斛含有多種藥效成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、抑制心血管與胃腸道疾病及止痛退熱等作用[3-7]。植物內生真菌(endophytic fungus)是指存在于健康植物根莖葉等組織內部，不會對宿主植物造成明顯傷害或者引起宿主植物組織明顯病癥的真菌[8]。真菌誘導子是來源于真菌的一種特定化學信號，在植物與真菌的相互作用中，能引起植物細胞合成積累次生代謝物，對植物具有專一性，它們主要是真菌的細胞表面結構或分泌物，可以是真菌菌絲體、滅活菌絲體、發酵液和分泌物等[9]。

目前，已有多名學者將從鐵皮石斛中分離得到的內生真菌制備成誘導子，探討誘導子對宿主生長與成分代謝的影響。陳曉梅等將從鐵皮石斛中分離的小菇屬(Mycenasp.)真菌MF24液體發酵制備成誘導子，與宿主原球莖共培養，發現真菌誘導子在早期可抑制原球莖生長，在后期可促進原球莖生長，并能促進原球莖中某些化學成分的產生或特異性積累，特別是對生物堿類成分尤為敏感[10-11]。宋經元等研究發現，內生真菌誘導子可提高宿主原球莖多糖含量[12-13]。潘超美等研究發現，誘導子對鐵皮石斛的愈傷組織、擬原球莖及不定芽均有不同程度的促生長作用，某些特定誘導子對根的分化有抑制作用[14]。侯丕勇等發現，誘導子可促進原球莖苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和脂肪氧化酶(LOX)活性的升高[15]。但是，研究誘導子對宿主組培苗生長與代謝成分影響的報道尚不多見。前期研究顯示，鐵皮石斛內生真菌DO14[擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsissp.)]、DO18[藍狀菌屬(Talaromycessp.)]、DO19[炭角菌科(Xylariaceae sp.)]、DO120[炭團菌屬(Hypoxylonsp.)]可顯著促進宿主生長與有效成分代謝[16]。為了探討內生真菌起活性作用的物質基礎，本研究將上述優良菌株制備成相應誘導子，并進行誘導子可溶性糖含量測定，為內生真菌資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內生真菌DO14、DO18、DO19、DO120與鐵皮石斛組培苗均由浙江農林大學省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室提供，詳見表1。

主要儀器：HVA-85全自動高壓蒸汽滅菌鍋(日本三洋電機株式會社)；SW-CJ-1C型雙人單面超凈工作臺(上海康路儀器設備有限公司)；JZ-100-B型接種器具殺菌器(上海稼豐園藝用品有限公司)；Milli-Q Academic超純水儀(美國Millipore公司)；UV2550紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)；KQ5200DE型數控超聲清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；MJP-250S型霉菌培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)；DGG-9070型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；FA1004B型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；HYG-A全溫搖瓶柜(江蘇太倉實驗設備有限公司)。蒽酮乙酸乙酯試劑，取1 g分析純蒽酮(批號：30015014，國藥集團化學試劑有限公司)溶于50 mL乙酸乙酯中，置于棕色瓶中保存；蔗糖(批號：40159760)購自國藥集團化學試劑有限公司；濃硫酸(批號：81007)購自深圳市冠泰化工有限公司；水為超純水；其他試劑為分析純。

表1 供試內生真菌

1.2 內生真菌的固體培養與液體發酵

將目標菌株從試管斜面挑出，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖、15 g/L瓊脂，pH值自然)上培養，待菌絲長滿平板后，用真菌打孔器打成小菌塊(5 mm×5 mm)，接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養基(含有200 g/L馬鈴薯、20 g/L葡萄糖，pH值自然)中進行發酵，每瓶接種10個菌塊，在 180 r/min、25 ℃條件下培養至一定階段，定期觀察菌液形態與顏色變化。

1.3 菌絲提取物(extract of mycelium，簡稱EM)誘導子的制備與可溶性糖含量的測定

將菌絲液體發酵液于121 ℃高溫滅菌20 min，用4層紗布過濾，收集菌絲，用無菌水洗滌3～5次，再用勻漿機打碎過濾，最后用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，即為EN誘導子溶液。將懸浮培養0、4、8、12、16、20 d的誘導子溶液，用蒽酮比色法[17]測定溶液中的可溶性糖含量，測定波長為620 nm，可溶性糖標準曲線方程為y=8.717 1x+0.014 7，其中y代表D620 nm，x代表濃度，r2=0.999 8，線性范圍為0.005～0.05 mg/mL，試驗重復3次。

1.4 乙醇沉淀、上層清液、蛋白-多溏部位誘導子的制備

按照圖1方法分離EM誘導子化學部位，將誘導子溶液于 80 ℃ 減壓濃縮至一定體積，按體積比1 ∶4加入95%乙醇，于25 ℃沉淀2 d，8 000 r/min離心5 min，收集醇沉物，減壓凍干得乙醇沉淀(ethanol sediment，簡稱ES)粉末，上清液減壓凍干得上層清液(supernatant liquor，簡稱SL)粉末；將醇沉物ES溶于少量蒸餾水，加適當體積Sevage試劑(三氯甲烷、正丁醇的體積比=5 ∶1)除蛋白，4 000 r/min離心5 min，取上清，通過截留分子量為2 ku的再生纖維素透析袋(長38 mm)用自來水透析48 h，用蒸餾水透析12 h，最后將透析袋內液體濃縮減壓凍干得蛋白-多糖部位(protein polysaccharides fraction，簡稱PPF)粉末，主要包括多糖和與多糖結合的蛋白等成分[18]，分別計算DO14、DO18、DO19與DO120各誘導子得率，公式如下：各誘導子得率=誘導子粉末質量/總菌絲質量。試驗重復3次。

1.5 統計學方法

2 結果與分析

2.1 誘導子培養液形態觀察

將DO14、DO18、DO19與DO120菌株從PDA培養基轉至PDB液體培養基懸浮培養后，菌絲塊形態與培養液顏色發生變化。DO14培養液為乳黃色，培養前期，菌絲塊周圍長出刺狀物，培養4 d時，菌絲塊與培養液呈混合凝膠狀，黏稠度較高，已無法分離菌塊，過濾較困難；DO18培養液為暗紅色，菌液較澄清，前期菌絲塊較集中，后期菌絲塊分散，容易過濾；DO19培養液為黑褐色，前期菌絲塊為黃色，培養1周后菌絲塊分散消失，肉眼不可見，菌液較渾濁，呈膠狀，黏稠度中等；DO120培養液為淡黃色，前期菌塊呈不規則形的較大顆粒狀，培養4 d時菌絲塊分散為細小顆粒，沉淀在底部，菌液澄清，過濾較容易。誘導子培養液形態觀察有助于掌握菌絲生長動態，便于后期誘導子菌絲的收集。

2.2 誘導子溶液可溶性糖含量動態變化

由圖2可見，DO14、DO18、DO19與DO120 EM誘導子溶液的可溶性糖含量隨著培養時間的延長而發生變化，在20 d培養期內，以上4種供試菌株在培養4 d時可溶性糖含量最高，分別達到1.530、3.484、1.188、3.015 mg/mL，而后呈下降趨勢，其中培養4～8 d的區間下降趨勢最明顯，培養后期變化趨于平緩。從誘導子溶液可溶性糖含量看，培養4 d為目標菌株最佳培養時間。

2.3 ES、SL與PPF誘導子得率比較

由表2可知，不同菌株ES、SL與PPF得率均存在顯著差異(P<0.05)，其中，DO120菌株ES、SL誘導子得率最高，分別達5.048 7、12.548 2 mg/g，DO14菌株PPF誘導子得率最高，達到0.840 7 mg/g。不同菌株誘導子的得率表現出差異，是內生真菌菌絲生長速率差異、菌絲代謝產物多樣性的體現。根據不同誘導子得率，可制備目標菌株特異性誘導子，進而探討誘導子的最佳生物學活性。

表2 不同菌株ES、SL、PPF誘導子得率比較(n=3)

注：同列數據后標有不同小寫字母表示在0.05水平上存在顯著差異。“*”表示全區組間比較后在0.05水平有顯著差異。

3 結論與討論

某些活性較強的內生真菌往往對植物存在一定的競爭性抑制作用，于是學者們將內生真菌制備成各種誘導子來研究其對植物生長與成分代謝的影響。結果表明，內生真菌誘導子也可以顯著影響植物的生長與成分代謝[19]。Wang等從紅豆杉(Taxuschinensis)樹皮中分離得到1株內生真菌黑曲霉(Aspergillusniger)，將其制備成誘導子溶液添加到紅豆杉懸浮培養細胞體系中，發現誘導子處理的紅豆杉紫杉醇含量提高了7倍，且誘導子濃度以碳水化合物總量計在40 mg/L時效果最好[20]。Zhao等將尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)Fat9菌株與鏈格孢屬(Alternariasp.)Fat15菌株制備成誘導子，添加到苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)毛狀根培養液中，發現誘導子溶液能顯著提高苦蕎麥毛狀根蕓香苷含量，且以多糖含量計Fat9、Fat15誘導子在濃度為200 mg/L時作用效果最好，蕓香苷含量分別達45.9、47.2 mg/L，分別是對照的 3.1、3.2倍[21]。Ming等在研究深綠木霉促進丹參酮生物合成的分子機制的過程中，發現深綠木霉菌絲水溶性提取物中的蛋白-多糖部位(PSF)能夠顯著提高丹參酮生物合成途徑中4種關鍵酶基因的表達，進而促進丹參毛狀根中丹參酮類成分的生物合成，且促進效果明顯好于上清液部位(SF)，同時，PSF誘導子以可溶性糖含量計在濃度為300 mg/L時的作用效果顯著好于濃度為40、150 mg/L時的[22]。因此可見，誘導子可溶性糖濃度、化學部位、培養時間等會顯著影響內生真菌誘導子生物學活性。

本研究首先觀察了DO14、DO18、DO19與DO120在培養不同階段菌絲與發酵液的形態特征，并以可溶性糖含量為指標，探討了不同培養時間EM誘導子溶液可溶性糖含量變化規律。結果表明，培養4 d時可溶性糖含量最高。以培養4 d的EM誘導子溶液為母液，用水提醇沉透析法分離成ES、SL與PPF 3個部位，根據不同部位的誘導子得率，可將ES、SL與PPF分別配制成不同濃度的誘導子加入鐵皮石斛組培苗培養基中，探討誘導子對鐵皮石斛生長與有效成分含量積累的影響，從而為下一步誘導子生物學活性、物質基礎與作用機制研究提供參考依據。