腸球菌屬耐藥機制研究進展*

劉 丹 綜述，王佳賀 審校

(中國醫科大學附屬盛京醫院老年病科，沈陽 110004)

腸球菌是存在于人類和動物腸道的正常菌群，既往被認為是對人類無害的共棲菌。自20世紀80年代以來，腸球菌引起的感染不斷增加，目前已成為引起醫院感染的重要條件病原菌，在革蘭陽性球菌中居第2位，僅次于葡萄球菌屬，可引起機體多種組織器官的嚴重感染，包括尿路感染、皮膚軟組織感染、心內膜炎、腹腔感染、腦膜炎、敗血癥等，甚至危及患者生命。近年來，腸球菌在臨床上的分離率不斷上升，危害性越來越大，被美國醫院感染監測系統(NISS)列為醫院感染的第2大病原菌，其檢出率僅次于大腸桿菌。由腸球菌引起的感染耐藥機制復雜，包括固有耐藥和獲得性耐藥[1]。隨著臨床抗菌藥物的廣泛使用，腸球菌對抗菌藥物的耐藥性和耐藥種類不斷增加，且臨床分離的腸球菌屬多為多重耐藥菌株，尤其是耐萬古霉素腸球菌(VRE)和氨基糖苷類高水平耐藥腸球菌(HLAR)，給臨床治療帶來極大的困擾[2]。目前尚缺乏治療VRE的特效藥物，只能根據藥敏檢測結果和耐藥基因表型檢測結果選用抗菌藥物。

1 腸球菌對糖肽類抗菌藥物的耐藥機制

目前認為糖肽類抗菌藥物是治療腸球菌感染的最后一道防線，但已出現對糖肽類抗菌藥物耐藥的腸球菌。自1988年在英國倫敦首次分離得到VRE以來，該耐藥菌又相繼出現在世界各地。美國疾病控制與預防中心(CDC)的數據顯示，1989年VRE在美國的分離率為0.3%，而在2000年已經上升至25.9%。我國VRE的分離率較歐美國家低，但近年來仍有不斷上升的趨勢。糖肽類抗菌藥物通過與細菌細胞壁上的D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-ALA-D-ALA)為末端的肽聚糖前體特異性結合，抑制肽聚糖的延伸和交聯，抑制細菌細胞壁的生物合成。耐糖肽類抗菌藥物腸球菌的產生是由于腸球菌細胞可產生一種前體，使其末端基因發生變化，導致糖肽類抗菌藥物分子無法與之結合，不能阻止細菌細胞壁的合成從而產生耐藥[3]。目前已證實耐糖肽類抗菌藥物腸球菌的表現型有VanA、 VanB、 VanC、VanD、VanE、VanG，除VanC為天然耐藥外其他均為獲得性耐藥，其中VanA、VanB、VanD的耐藥原因為D-ALA-D-ALA被D-丙氨酸-D-乳酸(D-ALA-D-LAC)所取代，而VanC、VanE、VanG的耐藥原因為D-ALA-D-ALA變成了D-丙氨酸-D-絲氨酸(D-ALA-D-SER)。

1.1VanA 由vanA基因編碼，對萬古霉素和替考拉寧高水平耐藥，耐藥機制包括D-ALA-D-ALA末端被D-ALA-D-LAC所取代和萬古霉素敏感結合位點被破壞兩部分。此外，有研究證實VanA型菌株帶有VanA基因的轉座子TN1546與IS1251在腸球菌中傳播VanA基因[4]。

1.2VanB 由vanB基因編碼，對萬古霉素可變水平耐藥，對替考拉寧敏感，對萬古霉素特異性耐藥。

1.3VanC 由染色體上的編碼基因vanC操縱子編碼，表現為低水平耐藥，主要耐藥原因為VanC催化D-ALA-D-SER替換D-ALA-D-ALA，從而降低萬古霉素的親和力[5]。

1.4VanD 由vanA基因編碼，表現型不穩定，易轉化為VanA菌株，對萬古霉素高水平耐藥，對替考拉寧敏感或中介。

1.5VanE 與VanC有較高的同源性，對萬古霉素低水平耐藥，對替考拉寧敏感。對萬古霉素耐藥機制與VanC類似，是由于萬古霉素結合靶點的D-ALA-D-ALA被D-ALA-D-SER所取代，從而使萬古霉素的親和力降低。

1.6VanG 臨床較少見，對萬古霉素低水平耐藥，對替考拉寧敏感，耐藥機制為由vanB編碼對萬古霉素低水平耐藥的蛋白酶，該酶可使萬古霉素結合靶點的D-ALA-D-ALA被D-ALA-D-SER所取代，親和力降低[6-7]。

目前研究證實VRE耐藥是由質粒介導，由于有質粒和各種轉座子的參與，VRE的傳播不僅使耐藥基因克隆擴增，而且還有耐藥基因在菌株間的平行轉移，且這種平行轉移易使耐藥基因轉移給其他的革蘭陽性球菌[8]。

2 腸球菌對氨基糖苷類高水平的耐藥機制

HLAR是醫院感染的重要病原菌，自1979年首次報道耐高水平慶大霉素腸球菌(HLGRE)的出現，氨基糖苷類高水平耐藥腸球菌引起醫院感染的發生率迅速增加，成為腸球菌耐藥嚴重性的又一表現[9]。氨基糖苷類抗菌藥物作用機制是通過作用于細胞核糖體的亞單位，抑制細菌蛋白質的合成，從而導致細菌死亡[10]。目前認為腸球菌對氨基糖苷類高水平耐藥的主要機制包括腸球菌產生氨基糖苷類修飾酶(AME)、氨基糖苷類抗菌藥物的轉移受到干預及氨基糖苷藥物作用靶點的改變等，其中最為重要的機制為AME,參與耐藥基因表達的主要AME包括O-磷酶轉移酶(APH)、O-核苷轉移酶(ANT)和N-乙酰轉移酶(AAC)[11]。

2.1AME 由質粒和染色體編碼，也與轉座子和整合子相關，耐藥基因在質粒交換和轉座子轉座作用的協助下可滲入敏感菌的遺傳物質中，且在同種或異種細菌之間廣泛傳播。目前國內外已檢測到與腸球菌耐藥有關的AME有APH、ANT、AAC及雙功能復合酶，各類AME又包括多種亞型。

2.1.1APH 由aph基因編碼，分為7個大種，每種又有不同的亞型。其中aph(2″)-Ⅰb在屎腸球菌中發現，屎腸球菌對慶大霉素呈中等水平以上耐藥，并破壞青霉素或糖肽類與氨基糖苷類抗菌藥物的協同作用，但對鏈霉素無效[12]。aph(2″)-Ⅰc基因出現在屎腸球菌和糞腸球菌感染中，其對慶大霉素呈中等水平耐藥，并抑制慶大霉素和氨芐西林、萬古霉素的協同作用。aph(2″)-Ⅰd基因在家禽、家畜分離的腸球菌中檢出率較高，可通過食物傳播給人類。aph(2″)-Ⅰe僅在屎腸球菌感染中發現，在HLGRE中所占比例低，可傳遞對慶大霉素和奈替米星的耐藥性[13]。aph(3″)-Ⅲa基因可在革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌之間轉移，產生對阿米卡星、卡那霉素等高水平耐藥，在HLAR中檢出率非常高。

2.1.2ANT ANT分為ANT(4′)、ANT(3″)、ANT(2″)、ANT(6′)、ANT(9′)5種，主要引起鏈霉素高水平耐藥腸球菌的產生，通過作用于鏈霉素藥物的2′、3′、4′、6′、9′位上的羥基(-OH)使其磷酸化，導致鏈霉素不能與核糖體亞基結合，但它不能抑制腸球菌蛋白質的合成[14]。

2.1.3AAC AAC分為AAC(2)、AAC(9)、AAC(6′)、AAC(3)4種。目前國內外已檢測到與HLAR有關的AAC有AAC(6′)-Ⅰi、AAC(6′)-Ⅱ、AAC(6′)-Ⅰm。其中AAC(6′)-Ⅰi存在于所有的屎腸球菌耐藥中，產生對鏈霉素、卡那霉素等耐藥，該酶可以減弱氨基糖苷類藥物與氨芐西林、萬古霉素的協同作用。AAC(6′)-Ⅱ也對慶大霉素、妥布霉素耐藥，首次發現于銅綠假單胞菌和熒光假單胞菌中。AAC(6′)-Ⅰm存在于屎腸球菌SF11770中，可在革蘭陽性球菌和革蘭陰性桿菌之間傳播[15]。

2.1.4雙功能復合酶 雙功能復合酶AAC(6′)-APH(2″)是目前為止發現的最重要的AME，由其進行酶反應的抗菌藥物包括除鏈霉素以外的所有氨基糖苷類抗菌藥物，且可抑制青霉素或糖肽類抗菌藥物與氨基糖苷類的協同作用[16]。臨床上HLGRE的出現均由該酶介導，目前大量的研究已證實HLGRE的主要耐藥基因為acc-(6′)-le-aph(2″)-la。

2.2耐藥基因的傳播 由于HLAR相關質粒和轉座子在腸球菌中大量存在，耐藥基因通過質粒和轉座子轉移到敏感細菌的遺傳物質中，使得HLAR可在腸球菌之間轉播[17]。

2.2.1質粒介導的耐藥基因 介導耐藥基因傳播的質粒包括性信息素應答性質粒、多宿主質粒和質粒pMG1。性信息素應答性質粒介導糞腸球菌之間耐藥基因的傳播，特點是傳播頻率高，引起的耐藥性都處于高水平。多宿主質粒可將腸球菌的耐藥基因轉移到葡萄球菌中，傳播頻率低。使耐藥基因在屎腸球菌和糞腸球菌之間轉移，增加多重耐藥菌產生的原因是質粒pMG1可在液體中進行質粒轉移[18]。

2.2.2轉座子介導的耐藥基因 氨基糖苷類雙功能復合酶AAC(6′)-APH(2″)的基因常形成轉座子Tn5281結構，該結構是糞腸球菌中分離的主要AME耐藥基因，在促進HLGRE基因整合到質粒上起重要作用，可在不同菌株之間傳播，從而增加HLAR的發生率[19]。

3 小 結

綜上所述，糖肽類藥物是通過抑制細菌細胞壁的生物合成來實現抗菌作用，而腸球菌屬對糖肽類抗菌藥物產生耐藥是由于腸球菌可產生一種前體作用于其末端，從而阻礙抗菌藥物發揮抑制細菌細胞壁生物合成的作用，目前國內外多項研究已經證實耐糖肽類抗菌藥物腸球菌的表現型有VanA、VanB、VanC、VanD、VanE、VanG 6種，每種表現型對不同糖肽類抗菌藥物的耐藥性也存在差異。腸球菌屬對氨基糖苷類藥物高水平耐藥的耐藥機制包括腸球菌產生AME、氨基糖苷類抗菌藥物的轉移受到干預及氨基糖苷藥物作用靶點的改變等，其中最為重要的機制為腸球菌產生AME，研究證實參與耐藥基因表達的主要AME包括APH、ANT、AAC及雙功能復合酶[20]。此外，耐藥基因可通過存在HLAR的質粒和轉座子轉移至敏感細菌的遺傳物質中，從而使HLAR可在腸球菌之間傳播。然而，腸球菌的耐藥基因簇既可天然攜帶，又可從外界獲得，還可在不同菌株或不同菌種之間傳播，VRE和HLAR的耐藥機制不僅局限于上述研究，對腸球菌耐藥機制還需進一步研究探討。

隨著抗菌藥物的廣泛應用，多重耐藥菌株越來越多，尤其是VRE和HLAR的檢出率不斷上升，使臨床腸球菌引起的感染越來越難治，因此，對于預防和控制耐藥菌株的產生極為重要[21]。本綜述通過對腸球菌耐藥機制的研究，對臨床控制耐藥菌株的傳播、合理選用抗菌藥物，以及對VRE和HLAR有效新藥的研制提供科學依據。

[1]COOMBS G W,PEARSON J C,DALEY D A,et al.Molecular epidemiology of enterococcal bacteremia in Australia[J].J Clin Microbiol,2014,52(3):897-905.

[2]ALIPOUR M,HAJIESMAILI R,TALEBJANNAT M,et al.Identification and antimicrobial resistance of Enterococcus Spp.Isolated from the river and coastal waters in Northern Iran[J].Sci World J,2014,30(14):287-458.

[3]IWERIEBOR B C,GAQAVU S,OBI L C,et al.Antibiotic susceptibilities of enterococcus species isolated from hospital and domestic wastewater effluents in alice,eastern Cape Province of South Africa[J].Int J Environ Res Public Health,2015,12(4):4231-4246.

[4]LI W X,LI J,WEI Q H,et al.Characterization of aminoglycoside resistance and virulence genes among enterococcus spp.isolated from a hospital in China[J].Int J Environ Res Public Health,2015,12(3):3014-3025.

[5]YAMANAKA H,TAKAGI T,Ohsawa M,et al.Identification and characterization of vancomycin-resistant enterococcus species frequently isolated from laboratory mice[J].Exp Anim,2014,63(3):297-304.

[6]JIA W,LI G,WANG W.Prevalence and antimicrobial resistance of Enterococcus species:a hospital-based study in China[J].Int J Environ Res Public Health,2014,11(3):3424-3442.

[7]WARDAL E,MARKOWSKA K,ZABICKA D,et al.Molecular analysis of VanA outbreak of enterococcus faecium in two Warsaw hospitals:the importance of Mobile genetic elements[J].Biomed Res Int,2014,20(14):575-577.

[8]SHIWA Y,YANASE H,HIROSE Y,et al.Complete genome sequence of enterococcus mundtii QU 25,an efficient L-(1)-Lactic Acid-Producing bacterium[J].DNA Res,2014,21(4):369-377.

[9]PADMASINI E,PADMARAJ R,RAMESH S S.High level aminoglycoside resistance and distribution of aminoglycoside resistant genes among clinical isolates of Enterococcus species in Chennai,India[J].Sci World J,2014,20(14):329-357.

[10]ESHAGHI A,SHAHINAS D,LI A M,et al.Characterization of an enterococcus gallinarum isolate carrying a dual vanA and vanB cassette[J].J Clin Microbiol,2015,53(7):2225-2229.

[11]WIJESURIYA T M,PERRY P,PRYCE T,et al.Low vancomycin MICs and fecal densities reduce the sensitivity of screening methods for vancomycin resistance in enterococci[J].J Clin Microbiol,2014,52(8):2829-2833.

[12]LAM M M,SEEMANN T,TOBIAS N J,et al.Comparative analysis of the complete genome of an epidemic hospital sequence type 203 clone of vancomycin-resistant Enterococcus faecium[J].BMC Genomics,2013,14(8):595-610.

[13]FERNANDES S C,DHANASHREE B.Drug resistance & virulence determinants in clinical isolates of Enterococcus species[J].Indian J Med Res,2013,137(5):981-985.

[14]BOBENCHIK A M,HINDLER J A,GILTNER C L,et al.Performance of vitek 2 for antimicrobial susceptibility testing of staphylococcus spp.and enterococcus spp[J].J Clin Microbiol,2014,52(2):392-397.

[15]SANTIAGO-RODRIGUEZ T M,RIVERA J I,CORADIN M,et al.Antibiotic-resistance and virulence genes in Enterococcus isolated from tropical recreational waters[J].J Water Health,2013,11(3):387-396.

[16]ABAMECHA A,WONDAFRASH B,ABDISSA A.Antimicrobial resistance profile of Enterococcus species isolated from intestinal tracts of hospitalized patients in Jimma,Ethiopia[J].BMC Res Notes,2015,8(2):213-215.

[17]OCHOA SA,ESCALONA G,CRUZ-CRDOVA A,t al.Molecular analysis and distribution of multidrug-resistant Enterococcus faecium isolates belonging to clonal complex 17 in a tertiary care center in Mexico City[J].BMC Microbiol,2013,13(7):291-311.

[18]REPIZO G D,ESPARIZ M,BLANCATO V S,et al.Genomic comparative analysis of the environmental Enterococcus mundtii against enterococcal representative species[J].BMC Genomics,2014,15(1):489.

[19]ZISCHKA M,KUENNE C T,BLOM J,et al.Comprehensive molecular,genomic and phenotypic analysis of a major clone of Enterococcus faecalis MLST ST40[J].BMC Genomics,2015,16(1):175-177.

[20]YUEN G J,AUSUBEL F M.Enterococcus infection biology:lessons from invertebrate host models[J].J Microbiol,2014,52(3):200-210.

[21]DANIEL D S,LEE S M,DYKES G A,et al.Public health risks of Multiple-Drug-Resistant enterococcus spp.in Southeast Asia[J].Appl Environ Microbiol,2015,81(18):6090-6097.