染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用綜述

張文玲，劉曉婷，張立文，王成彬

解放軍總醫院 醫學檢驗中心，北京 100853

自20世紀 60年代后期染色體條帶技術開展以來，染色體核型分析作為產前診斷的“金標準”被廣泛應用于臨床，但其只能檢測出染色體片段＞5 Mb的異常，無法發現染色體上微小片段(小于3 ～ 5 Mb)的缺失及重復[1]，無法準確定位額外小標記染色體(small supernumerary marker chromosomes，sSMC)的來源；而且染色體核型分析需要進行細胞培養，報告周期長(10 ～ 14 d)。染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)是一項新興的染色體分析技術，能夠檢測出大于1 kb的拷貝數變異(copy number variation，CNV)微缺失/微重復，故而被稱為“分子核型”[2]。與染色體核型分析相比，CMA具有更好的分辨率、更高的自動化程度和更快的檢測周期，彌補了染色體核型分析的不足。2013年美國婦產科醫師學會建議當胎兒存在一個或多個系統超聲異常并需要進行侵入性產前診斷時應用CMA技術[3]。本文對CMA的檢測原理、在產前診斷中的應用、CMA結果解讀與遺傳咨詢、CMA的優勢與局限性等進行系統綜述，為該領域科技人員提供參考。

1 CMA的檢測原理

根據芯片設計與檢測原理的不同，CMA技術可分為基于微陣列的比較基因組雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)技術和單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism，SNP)微陣列技術。

aCGH是在比較基因組雜交技術的基礎上發展起來的芯片技術，其原理是分別用不同顏色的熒光(如綠色的Cy3熒光素和紅色的Cy5熒光素)標記待測樣品與健康人參照樣品全基因組DNA等比例混合后，與載體上固定好的微陣列序列競爭性雜交，通過計算機軟件分析比較待測樣品和參照樣品兩種熒光強度，待測樣品中的缺失區域會產生更強烈的Cy5信號(紅色)，而重復區域會產生更強烈的Cy3信號(綠色)，從而確定待測樣品全基因組水平上拷貝數變化情況。aCGH的分辨率取決于所用探針的數量和類型以及它們在整個基因組中的分布。最初用于aCGH的探針來源于細菌人工染色體克隆，通常為100 ～ 150 kb，現多被寡核苷酸探針(25 ～ 75 bp)取代，因寡核苷酸探針能提供更高的分辨率與更好的重現性[2]。

與aCGH技術不同，SNP微陣列技術只需標記待測樣品的基因組DNA并與SNP微陣列雜交。給定SNP的A和B等位基因用不同的熒光染料標記，測量待測樣品的絕對熒光強度，并通過與正常參照樣品數據庫的熒光強度(計算機模擬)比較來確定拷貝數變化。臨床應用的大多數SNP陣列是包含SNP探針與拷貝數探針的雜合陣列。與aCGH相比，SNP陣列具有檢測等位基因失衡的優勢，除了能檢測CNV外，SNP微陣列技術還能夠檢測出大多數的單親二倍體與三倍體[2]。

目前大多數臨床使用的CMA平臺具有“靶向性”，可以檢測靶向區域的20 ～ 50 kb的不平衡和與非靶向區域中100 ～250 kb的不平衡[4]。這種設計減少了對臨床意義不明確的拷貝數變異(variant of uncertain significance，VOUS)的檢出，同時保持平臺高效檢測亞顯微不平衡染色體重排，以及與已知基因組疾病相關的缺失與重復。然而，部分學者主張使用全基因組陣列以提高靈敏度。全基因組陣列在發現新的亞顯微綜合征中作用顯著，同時全基因組陣列將檢測到更多VOUS。申請CMA檢測時，臨床醫師應了解當前使用的各種CMA平臺及其局限性。

2 CMA在產前診斷中的應用

目前，CMA的臨床應用主要有：1)兒童復雜、罕見遺傳病在排除染色體病、代謝病及脆性X綜合征之后的全基因組CNV檢測。2)對自然流產、胎死宮內、新生兒死亡等妊娠產物的遺傳學檢測。3)對產前診斷中核型分析結果異常但無法確認異常片段的來源和性質者進行DNA水平的更精細分析。4)對產前超聲檢查異常而染色體核型分析結果正常的胎兒進一步行遺傳學檢測。在產前診斷領域中，CMA主要應用于后兩種[5]。

2.1 明確核型分析異常片段的來源和性質 在產前診斷中，sSMC的發生率為0.075%[6]。sSMC的表型效應與其來源、片段大小以及是否含有重要的功能基因和調控基因等相關，而染色體核型分析不能確定sSMC的來源和性質。CMA技術能夠在分子水平精確定位sSMC片段來源，確定包含的基因及其功能，對染色體疾病基因型-表型關系的診斷具有重大的應用價值[7-9]。此外，染色體易位的形成往往伴隨著一些微小片段的丟失或重復，受檢測水平的限制，傳統細胞遺傳學診斷出的平衡易位核型很有可能隱藏著眾多的微小不平衡。Schluth-Bolard等[10]發現，約40%的染色體平衡易位通過CMA進一步檢測，可能為不平衡易位。對于產前診斷中染色體核型檢查發現的胎兒染色體平衡易位，CMA技術可以進一步明確該易位是否打斷編碼基因、是否在斷裂點附近存在小片段的缺失或重復，這些都有助于明確胎兒染色體平衡易位是否具有病理性質，有利于遺傳咨詢及胎兒預后評估[11]。

2.2 對產前超聲檢查異常而染色體核型分析正常的胎兒進一步檢測 CMA用于產前診斷染色體異常時表現出優異的診斷性能(靈敏度96.2%，特異性100.0%)[12]。與染色體核型分析相比，CMA能夠提供超過常規核型分析的診斷信息，顯著提高胎兒染色體異常的檢測成功率和診斷率[13-14]，尤其當超聲檢查發現胎兒結構異常時，產前CMA分析最有效[3]。Hillman等[15]的系統評價發現，常規核型分析“正常”，不考慮診斷指征時，CMA可以檢測到3.6%的基因組失衡；當診斷指征是超聲結構畸形時，檢測到的基因組失衡將增加到5.2%。Hillman等[16]的前瞻性隊列研究證實，當胎兒超聲檢查異常時，與常規核型分析相比，CMA提高了4.1%的異常檢出率。胡婷等[17]對477例已排除常見染色體非整倍體的超聲異常胎兒羊水樣本進行CMA檢測，檢出致病性CNV 24例，檢出率為5.03%。其中62例多系統結構異常胎兒中檢出致病性CNV 6例，檢出率為9.68%；147例單系統結構異常胎兒中檢出致病性CNV 11例，檢出率為7.48%；268例超聲軟指標異常胎兒中檢出致病性CNV 7例，檢出率為2.61%，多系統結構異常胎兒具有更高的CNV檢出率。De Wit等[18]的文獻系統評價也顯示，超聲異常限于一個解剖系統的胎兒攜帶致病性CNV的概率為3.1% ～ 7.9%，這取決于受影響的解剖系統；對于多發性超聲異常胎兒，這一概率增至9.1%。多項研究均證實CMA在不同表現的胎兒超聲異常中的診斷和預后價值，如生長發育遲緩[19]、NT增厚[20-21]、心臟異常[22-25]、神經系統異常[26-27]等。國內外均已提出專家共識，建議當胎兒存在一個或多個超聲異常并需要進行侵入性產前診斷時，推薦使用CMA；對于胎兒核型分析結果不能確定染色體畸變情況時，建議采用CMA技術進一步分析以明確診斷[3,5]。

3 CMA結果的解讀

2011年美國醫學遺傳學會發布了CNV解釋指南，建議采用5級報告系統，即致病性的、可能致病性的、不確定的、可能良性的或良性的CNV[28]。CMA報告應提供以下與報告的CNV相關的特定信息：細胞遺傳學位置(染色體和條帶)；CNV類別(即缺失或重復)及機制(如果已知)；CNV大小與基因組構建的坐標(即hg19)；5級制度界定的重要聲明(包括證據和參考文獻)；所涉及的基因(如果CNV與已知綜合征相關，則列出與病癥相關的基因；其他情況下列出所有參考序列基因)；適當的臨床隨訪建議。

確定CNV的臨床意義可以參考已發表的病例報道、病例對照分析、病例綜述等資料，查閱共享的公共數據庫，如DGV數 據 庫(http：//dgv.tcag.ca)、DECIPHER數 據 庫(http：//decipher.sanger.ac.uk)、OMIM數 據 庫(http：//www.omim.org)、UCSC數據庫(http：//genome.ucsc.edu)、ISCA數據庫(https：//www.clinicalgenome.org)和PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)等，數據庫的不斷完善對規范和明確CMA結果的解釋及遺傳咨詢起著重要作用。

雖然CMA具有檢測1 kb堿基范圍內CNV的潛力，但在產前檢查中，大多數臨床實驗室多報告已被充分驗證且在已知致病區域中的CNV。在這些臨床重要區域之外的CNV通常僅在滿足特定標準時才報告。這些標準因實驗室而異，但通常包括大小閾值(＞1 ～ 3 Mb)以及CNV含有OMIM基因等要求。

4 CMA產前診斷的遺傳咨詢

隨著醫學基礎研究的深入，對CNV的臨床解釋可能發生改變，原本認為良性的CNV可能在一定時間后被認為是致病性的。類似這樣的問題，在產前診斷中很可能導致法律糾紛。因此，CMA檢測前患者充分的知情同意與檢測后CMA結果的咨詢解釋不可或缺。臨床CMA的報告應由具有適當專業培訓和認證的人員進行，該測試的理想實驗室設置是具有細胞遺傳學和分子遺傳學專業檢測能力的實驗室[28]。

在進行CMA檢測前與患者討論非常重要。可以與患者討論檢測目的、方法學、獲取樣本的選項(即羊膜穿刺術、絨毛膜取樣、血清或組織)、不完全外顯率和變異表達率的不可預測性以及檢測的局限性等[29]。除可能檢測到VOUS外，CMA還可能檢測到與成人時期發病的疾病相關的遺傳異常，某些類型的陣列還可以識別血緣關系(血親關系或亂倫)和非親緣關系，這些與醫學倫理相關的問題需要給予關注。報告的信息類型和數量取決于所使用的陣列類型以及執行分析的實驗室策略。在一項評估產前CMA知情決策水平以及影響決策因素的調查中發現，只有49%的醫師作出了明智的決定，“信息越多越好”成為影響被調查者接受產前CMA決定的主導因素[30]。因此，在患者接受CMA檢測之前，遺傳咨詢和知情同意是必不可少的。

同樣，檢測后CMA結果的咨詢解釋也極為重要，非預期診斷的報告并不少見。Gijsbers等[31]認為，隨著CMA分辨率越來越高，實驗室程序不斷改善，將有越來越多VOUS被發現。CMA在臨床應用中所面臨的最大困難之一是臨床醫師如何對VOUS進行遺傳咨詢。即使CMA檢測已包括知情同意過程，許多患者依舊對結果不確定的可能性缺乏足夠了解，并且在收到異常結果后需要決定是否繼續妊娠時感到非常痛苦[32]。在對193名產前遺傳咨詢師進行的一項調查中，當CMA結果發現VOUS時，只有59%的醫師能夠輕松提供遺傳咨詢，只有43%的醫師能夠很好地幫助患者做出終止妊娠的決定[33]。由于越來越多地使用產前微陣列檢測，不確定的檢查結果越發常見，因此需要更詳細的檢測前后咨詢，以及為醫師提供更多的教育資源，以便他們能夠更好地服務患者，確保患者可以做出恰當的決定。

5 CMA在產前診斷應用中的臨床指南

美國婦產科醫師學會于2009年首次提出在產前診斷中應用CMA技術，建議常規核型分析仍然是產前診斷的主要細胞遺傳學工具，CMA目前不能代替傳統細胞遺傳學在產前診斷中的應用。在胎兒結構異常情況下可以進行CMA檢測。在傳統染色體核型正常且胎兒沒有結構畸形的情況下，也可向已接受產前診斷風險并了解VOUS可能性的婦女提供CMA[1]。美國醫學遺傳學會建議對CMA檢測到染色體失衡情況的后續分析，應包括患者的細胞遺傳學或熒光原位雜交研究、親本評估以及臨床遺傳評估和咨詢等[34]。

美國婦產科醫師學會和美國醫學遺傳學會在2013年更新了CMA在產前診斷中應用的指南，建議無論母親的年齡或其他風險因素如何，都應通過篩查或診斷檢測為孕婦提供非整倍性的產前評估。當胎兒結構異常和(或)死產的情況下進行遺傳分析時，可以使用CMA代替常規核型分析。在胎兒結構正常的情況下進行侵入性產前診斷時，可以進行CMA或常規核型分析。由于CMA發現的大多數致病性CNV與母親年齡增加無關，所以檢測不應局限于35歲或以上的女性[3,35]。2011年加拿大婦產科學會和加拿大醫學遺傳協會在產前診斷中應用CMA技術的規范中聯合指出，CMA不建議用于結構性染色體異常低風險的妊娠(如高齡孕婦、母體血清學篩查陽性、先前的三體性或胎兒超聲“軟指標”異常)，但在超聲或磁共振成像檢測到胎兒結構異常的情況下可以使用CMA。如果快速非整倍性篩查是陰性的并且確保適當的檢測周期，則可以CMA代替核型分析。任何有資格進行CMA檢測的孕婦，在檢測之前都應該先接受醫學遺傳學家的咨詢，以便詳細了解CMA分析的好處、局限性、可能的 結果和解釋CNV的困難[36]。2017年更新后的規范建議當檢測到多系統胎兒畸形或頸部半透明NT≥3.5 mm時，應在正常快速非整倍性篩查后提供CMA。為了盡量減少不確定結果的報告，建議產前診斷不常規報告小于500 kb缺失或1 Mb重復的VOUS[37]。

6 CMA在產前診斷應用中優勢與局限性

美國醫學遺傳學會指出，與核型分析相比CMA的優勢在于：1)可以分析更廣泛的標本類型，不需要組織培養(CMA同樣適用于未培養的絨毛、羊水、胎兒組織和血液，包括儲存的樣本和石蠟塊)。2)分辨率更高，可以鑒定傳統染色體核型未發現的微缺失和微重復。3)檢測平臺可定制，可以根據特定要求而在感興趣的區域增加探針密度，調整檢測范圍。4)更直觀準確地描述核型上發現的結果，精準定位異常片段來源，客觀數據的解釋，而不是對帶強度的主觀視覺評估，對基因型-表型關系及預后給予更準確診斷，從而利于遺傳咨詢[35]。

CMA也存在自身的局限性：1)不能有效測出基因組平衡的染色體易位及倒位。2)低水平嵌合的檢出依賴于平臺種類、樣本類型、DNA質量、數據質量以及不平衡的大小等因素。3)可能無法闡明遺傳失衡的染色體機制，缺乏關于CNV機制的信息(核型將在大多數情況下提供此信息，如不平衡易位，標記染色體等)。4)可能無法檢測或難以檢測到四倍體或其他多倍體。5)無法檢測到平臺上未覆蓋基因組區域的CNV。6)受芯片設計所限，不可能檢測出與特定綜合征相關的所有相關位點異常，陰性CMA結果不能100%排除染色體疾病。7)并非所有的CNV都是致病性的，CMA可能會檢測到VOUS。

7 結語

與傳統染色體核型分析相比，CMA提供了更高的分辨率，可以有效診斷額外6%的先天性異常胎兒的染色體微缺失和微重復[38]。因為不需要經過細胞培養，CMA具有更快的檢測周期，這個優點在宮內胎兒死亡、自發性流產和妊娠晚期羊膜穿刺術中尤其明顯。盡管VOUS的檢出會給CMA的咨詢解釋帶來挑戰，但隨著更多大規模前瞻性隊列研究和CMA在產前診斷中的應用，CNV數據庫將不斷完善，更多染色體病基因型-表型關系將不斷被闡明，CMA在產前診斷領域將展現更大的應用價值。