牛羊檢疫的技術要點探討

楊偉翔，李 娟

（廣東省深圳市寶安區動物衛生監督所，廣東深圳518101）

牛羊臨床常發的疾病有消化道疾病、呼吸道疾病以及全身感染性菌血癥等，其中細菌性感染所占比例能占到臨床病例的70%以上，對養殖危害巨大，故快速準確地對細菌性感染進行檢疫對臨床意義重大，下面筆者以此為話題和大家作一下探討。

1 牛羊消化道特點

牛羊為反芻動物，其消化道有別與單胃動物，牧草經口腔首先進入瘤胃進行消化，而瘤胃中的消化過程非常復雜，因牧草植物纖維含量較高，纖維本身屬于多糖的一種，其本質也是由單糖分子構成。無論是單胃動物還是反芻動物，其消化道中的消化液都不含纖維素酶成分，不會對纖維素產生分解作用。對于單胃動物來講，植物類纖維主要起到清掃腸道的作用，對于反芻動物而言，雖然它們同樣不能直接分解纖維素，但由于瘤胃中含有大量的益生微生物，如細菌、真菌、纖毛蟲等，這些微生物對纖維類物質能起到分解作用，最終形成有機酸被機體吸收，故瘤胃環境是偏酸性的，酸性環境不利于其他有害菌的生長，利于維持整個微生態的平衡。

2 致病菌的鑒定

由于消化道中有大量益生微生物干擾，故需要加以區分鑒別。常用的判斷方法有溶血法，如果分離到的細菌有溶血作用，則代表對動物有一定毒性，還有動物模型法，常用的動物為小白鼠，將分離的可疑菌通過液體培養基增殖后，通過腹腔注射入小鼠體內，如果和空白組相比，試驗組小鼠明顯出現食欲下降、精神不振、全身組織器官炎癥壞死甚至死亡等情況，則代表分離的菌株是致病菌。但實際存在的問題是，已經可以證明有少部分的菌株即使是非致病性也有一定的溶血作用，同時有些正常菌株在注射入腹腔后，也會引發腹膜炎，使得實驗小鼠表現一系列臨床癥狀，導致判斷結果的不確定性增加。

3 檢疫技術

為了克服上述缺陷，目前有兩種比較成熟的方法用以解決標準判定問題，分別為菌群對比法和分子生物學法。

3.1 菌群對比法

菌群對比法依賴大數據，簡而言之就是將健康狀態下的牛羊，通過測定不同生長階段的瘤胃微生物菌群結構種類，匯總一個整體數據，這個數據即是一個健康動物的參考標準，如果發生細菌性消化道疾病，則瘤胃中的微生態菌群結構必然出現大的改變，通過對比正常菌群的結構就能快速判斷出疾病類型和感染菌株的種類，哪種數量明顯增加的菌種即為感染的致病菌，將其分離保存備用。

保存的致病菌菌株有何作用呢，一般會用在兩個方面，一是藥敏數據的測定，常用的方法是紙片法和試管法，藥敏試驗可以測定出分離的致病菌株對應的敏感藥物種類，繼而選用敏感抗生素進行治療。還能通過橫向和縱向對比藥敏數據，判斷養殖場的菌株耐藥變化情況，便于及時調整用藥方案，減少耐藥情況的發生。二是致病菌株可以人為擴大培養，并通過物理或化學方法滅活后，制備成自家苗免疫健康羊只，便于及時控制疫情，如羊大腸桿菌性腹瀉疫苗就是將致病性大腸桿菌分離純化，通過普通肉湯培養基進行培養擴增，加入甲醛溶液滅活后，再加入鋁膠佐劑，每只羊視個體大小肌肉注射0.5～2.0ml，一周之內便可產生高滴度的大腸桿菌抗體，保護健康羊只不受感染。

3.2 分子生物學法

通過測定基因的序列和基因庫中的致病微生物的序列進行對比，如果重合度相同，則代表所分離的菌株為致病性微生物，反之則是非致病性的。分子生物學法結果比較直觀和準確，但需要人類建立龐大的基因數據庫，目前這個基因庫還不是十分的完善，且其中可能有一定概率的錯誤，后期需要大量實驗去補充和修改。目前這個基因庫中的數據以國外研究較多，由于我國的養殖模式、氣候環境、牛羊品種、飼草種類等和國外有一定差異，結果只能作為參考，同時希望我國政府能夠重視這項工作，使我國的檢疫水平能夠上一個新臺階。

4 呼吸道和全身感染

呼吸道和全身菌血癥性感染與消化道感染性疾病不同，前兩者不存在自身微生態系統，其本身環境純凈，呼吸道中可能存在極少量的條件致病菌，而機體內環境中更是不會存在微生物。當發生感染后，只要無菌操作規范，基本分離到的菌都是確定的致病菌株，不存在像消化道那樣有益生微生物的干擾情況，因此，呼吸道和全身感染性病原確診相對簡單，病原分離后可通過形態觀察、生物學特性鑒定、血清學鑒定、分子生物學方法等對結果進行判斷。

5 臨床常見致病菌的檢疫

5.1 沙門氏菌病的檢疫

牛羊沙門氏菌感染類型多為鼠傷寒沙門氏菌、都柏林沙門氏菌和流產沙門氏菌，主要發生于腸道，生殖道中也能分離到。沙門氏菌的菌體形態、菌落外觀以及染色特征等與大腸桿菌很像，需要經過生化鑒定才能將二者區分。最常采用的方法是鑒別培養基法，由于大腸桿菌能發酵乳糖，而沙門氏菌不發酵，故在麥康凱培養基上大腸桿菌顯粉紅色菌落，沙門氏菌為無色菌落，在伊紅美藍瓊脂上培養時，表面帶有金屬光澤的菌落是大腸桿菌，若為中間黑色，四周環狀透明的菌落，則為沙門氏菌。另外，沙門氏菌代謝過程中能產生硫化氫，遇到亞鐵離子便生成黑色沉淀，可以通過三糖鐵培養基將二者鑒別。利用生化反應的特征不同進行病原鑒別可使疫情得到快速判斷。

5.2 布氏桿菌病的檢疫

布氏桿菌病主要表現慢性或隱性感染，其檢疫一般通過血清學檢查和變態反應檢查。血清學檢查有兩種，一種是通過已知抗體檢查病料中是否有布氏桿菌抗原，常用方法有熒光抗體技術、反向間接凝集試驗、間接炭凝集試驗和免疫組化法等；另一種是通過已知抗原檢測感染后7～15d之內的可疑病畜體內是否存在高滴度的抗體，通過抗原抗體凝集試驗、ELISA等方法進行檢查。變態反應檢查適用于大群動物的檢疫，檢測時將布氏桿菌水解素以0.2～0.3ml的量注射到牛羊的尾根皺褶部位或肘關節后側無毛部分的皮內，注射后觀察24～48h，如果發生紅腫，則變態反應呈陽性，可以斷定羊只感染。變態反應法檢出率高，結果準確，水解素注射后不會產生抗體，對后期血清學檢查無影響，臨床應用較為廣泛。

5.3 魏氏梭菌的檢疫

魏氏梭菌是消化道常見感染菌，由于本菌厭氧且對糖類分解作用強，絕大多數的糖類如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉、糊精等都可分解，分解后產酸產氣劇烈，利用這一特征，可設計牛乳暴烈發酵試驗來判定。將牛乳培養基置于無菌試管中，接種可疑菌落后液面用滅菌石蠟液封，37℃恒溫培養約6～8h，可見培養基中產生大量氣泡，由于發酵過程產酸，能將乳中酪蛋白凝固，使得外觀看起來如海綿狀，產生的氣泡可將凝固的酪蛋白沖散，外觀可見動態的發酵過程，故稱暴烈發酵試驗，這個試驗可用于快速檢測魏氏梭菌感染。

6 討論

除了沙門氏菌、布氏桿菌、魏氏梭菌外，還有巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、葡萄球菌等重要細菌類型在臨床同樣比較常見，鑒定方法大同小異，主要為病原分離、染色觀察、生化鑒定、血清學鑒定、分子生物學鑒定等。和病毒感染不同，細菌感染目前都有針對性的敏感抗生素進行治療，只要治療時機恰當，用藥科學，大部分的細菌感染都預后良好。由于我國畜牧業發展水平和國外發達國家相比還有一定差距，臨床用藥監管不嚴格，臨床上濫用抗生素的情況還存在，最終導致耐藥菌株產生的速度加快，同時藥物在機體中的代謝時間延長，肉、奶等食品中的藥物殘留也加大，嚴重危害食品安全，我國政府一定要予以重視。