人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

白雪晶，馮 磊，徐文波,羅 旋，鄢東海(.昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，云南省玉溪市人民醫(yī)院，云南 玉溪 65300；.昆明醫(yī)科大學(xué)，云南 昆明 650500)

血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)覆在血管內(nèi)膜，其具有重要的生理功能，廣泛參與了炎性反應(yīng)、血管新生、免疫應(yīng)答、動(dòng)脈粥樣硬化、血管張力調(diào)節(jié)等生理及病理過(guò)程[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)與許多心血管疾病的發(fā)生有關(guān)，冠心病的發(fā)生與血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與其功能異常有密切的關(guān)系[2]。內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)是研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)與多種疾病關(guān)系的重要方法，是目前最簡(jiǎn)單可靠的被廣泛運(yùn)用于生理研究的人類血管細(xì)胞。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷進(jìn)步，文獻(xiàn)報(bào)道了一種儀器，使用這種儀器內(nèi)，皮細(xì)胞可以從人類的臍靜脈中分離出來(lái)而不受污染[3]。但是作為基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，筆者仍然需要探索一種適用于科研工作者的分離純化HUVECs的方法。

1973年Jaffe等首先報(bào)道了內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法[4]，以后人們?cè)诖嘶A(chǔ)上不斷完善和改進(jìn)，以獲得性狀穩(wěn)定、純度較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞，并可較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)(可傳6～10 代)，內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)關(guān)鍵在于獲取、純化。作為HUVECs培養(yǎng)的第一步，細(xì)胞的獲取方法對(duì)細(xì)胞純度及含量至關(guān)重要，在培養(yǎng)細(xì)胞的獲取方法上,有酶法和非酶法兩種。

1 細(xì)胞獲取方式

1.1非酶法：非酶法主要包括機(jī)械刮取、組織塊移植兩種。但是機(jī)械刮取方法易損傷細(xì)胞，組織塊移植易混雜其他血管壁細(xì)胞，近幾年來(lái)這兩種方法已較少使用。

1.2酶消化法：這種方法的主要步驟是用酶灌注臍靜脈，收集內(nèi)皮細(xì)胞后接種培養(yǎng)。每一個(gè)過(guò)程都影響著HUVECs的純度和活力。消化時(shí)間是關(guān)系到內(nèi)皮細(xì)胞活力和純度的重要步驟，消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易混入其他雜細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞自臍靜脈脫離后在培養(yǎng)液中較難存活，使細(xì)胞純度和細(xì)胞活力都下降；反之,消化時(shí)間過(guò)短,則獲取的細(xì)胞較少，經(jīng)過(guò)大量研究，消化時(shí)間為10～15 min較為理想[5]。而酶是成功的關(guān)鍵步驟，早期探索了三種酶處理臍靜脈、分離內(nèi)皮細(xì)胞的方法，不同實(shí)驗(yàn)研究表明，不同的酶有不同的優(yōu)勢(shì)，用膠原酶消化的細(xì)胞數(shù)最多,平均每根臍帶可獲取(2～5)×106個(gè)細(xì)胞,但有時(shí)混雜少量成纖維細(xì)胞；鏈絲菌蛋白酶消化獲取的細(xì)胞數(shù)略少于膠原酶,但很少混雜成纖維細(xì)胞；胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞有毒性作用,且消化獲取的細(xì)胞數(shù)較少,不利于細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。

目前常用的酶主要是胰蛋白酶和膠原酶。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用的是胰蛋白酶，因?yàn)橐鹊鞍酌篙^膠原酶價(jià)廉易得，能獲得的細(xì)胞數(shù)量較多，成活率也較高。劉文等研究表明胰酶消化法能夠獲得大量且純度高的HUVECs[7]。近幾年國(guó)內(nèi)外的研究者也常選用膠原酶，包括Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶，Ⅰ型膠原酶運(yùn)用較廣泛，運(yùn)用Ⅱ型膠原酶也能成功獲取足量細(xì)胞。羅銳等通過(guò)實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)選用Ⅰ型膠原酶作為血管內(nèi)皮細(xì)胞分離酶，與其他酶(胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶)相比，消化效率適當(dāng)，細(xì)胞量較多，結(jié)構(gòu)較為完整，且細(xì)胞成團(tuán)生長(zhǎng)，容易存活[8]；但是陳小翠等人采用Ⅱ型膠原酶灌注消化人臍靜脈，也獲得了高純度、高活性的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞[9]。也有研究表明，Ⅰ型膠原酶消化分離獲得的HUVECs純度高、活力強(qiáng),而胰蛋白酶消化分離HUVECs可以降低非內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁能力，因此,二者混合消化是一種經(jīng)濟(jì)且實(shí)用的獲取HUVECs的方法[10]。

2 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)

HUVECs 是一種低增殖能力的細(xì)胞，體外生長(zhǎng)能力較差，增殖緩慢，因此人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)要注意以下幾點(diǎn)：內(nèi)皮細(xì)胞通常需要加入高濃度(20%)的胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS)才能滿足其生長(zhǎng)需要。目前，較常用的培養(yǎng)基是M199培養(yǎng)基，含有10%～20%的FBS及ECGS，但是BalaK等人的研究發(fā)現(xiàn)[11]，在含高濃度FBS( 200ml/L) 的M199培養(yǎng)基中添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子仍不能滿足臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)需求，而且這種培養(yǎng)基還存在一些問(wèn)題，如由于血清濃度過(guò)高，細(xì)胞容易老化，傳代的代數(shù)較少，不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，同時(shí)FBS中含有各種不同含量的生長(zhǎng)因子，是否需要加入的生長(zhǎng)因子以及加入的量難以把握[12]。也有研究通過(guò)加入一定濃度的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)或堿性成纖維因子( basic fibroblast growth factor，bFGF)[13]來(lái)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，但是生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴，難以推廣使用。而且加入細(xì)胞因子對(duì)于繼續(xù)研究可能有干擾作用，在冠心病形成諸多的參與因子中，VEGFs和bFGF等因子是調(diào)節(jié)新生血管成熟的重要生長(zhǎng)因子，李海云等人的研究表明，冠心病心肌缺血越嚴(yán)重，血清VEGF的含量越高[14]；也有研究表明，人血清中bFGF增高可能是冠心病發(fā)生的新型風(fēng)險(xiǎn)因子[15]，而人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞最常用于心腦血管疾病的研究，這容易對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，所以經(jīng)過(guò)不斷探索，最近許多研究使用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(Endothelial Cell Medium，ECM),其成分固定,且FBS濃度僅為5%，ECGS為1%。這種培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)好，死細(xì)胞較少，且傳代后貼壁率高，ECM 培養(yǎng)基能夠選擇性的促進(jìn)人微血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)中的增殖和生長(zhǎng)，并為其達(dá)到最理想營(yíng)養(yǎng)平衡狀態(tài)[16]。另外，細(xì)胞培養(yǎng)在原代、傳代時(shí)營(yíng)養(yǎng)液一般都需要添加血清，選擇高質(zhì)量的血清是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，較常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、人血清等，目前較常用的是胎牛血清。

3 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

不同器官和組織起源的內(nèi)皮細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、表型和功能特性等方面都不相同，鑒別內(nèi)皮細(xì)胞的方法有多種，主要是依據(jù)顯微鏡下形態(tài)學(xué)特征、特異性抗原的表達(dá)來(lái)鑒別的。

3.1形態(tài)學(xué)觀察：倒置相差顯微鏡可以初步鑒別，研究發(fā)現(xiàn)[17-18]，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞貼壁單層生長(zhǎng),初為圓形、橢圓性或團(tuán)塊狀，后逐漸呈短梭狀或鋪路石樣鑲嵌排列，細(xì)胞為扁平多角形，邊界清楚，胞核清晰可見(jiàn)，呈圓形或橢圓形。HE 染色胞核呈藍(lán)色、卵圓形，位于中央，大而不規(guī)則，可見(jiàn)明顯的核仁，胞質(zhì)均勻，胞質(zhì)呈粉紅色，胞膜較清楚，胞漿豐富。根據(jù)培養(yǎng)條件的差異，細(xì)胞貼壁的時(shí)間稍有差別，接種數(shù)小時(shí)(2～6 h不等，多為2～3 h)后開(kāi)始貼壁，1 d左右貼壁完全，1～2周左右可匯合成片；傳代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，通常1 h左右開(kāi)始貼壁，3～7 d可匯合成片，細(xì)胞分布均勻，邊界清楚，細(xì)胞核有時(shí)呈雙核或多核[19]。

3.2免疫組織化學(xué)染色：僅依靠形態(tài)學(xué)來(lái)鑒別內(nèi)皮細(xì)胞是不夠準(zhǔn)確的，可結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)法來(lái)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，Ⅷ因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征性標(biāo)志之一，目前鑒定HUVECs最有效的方法是檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原。Ⅷ因子的穩(wěn)定性和半衰期取決于VWF(von Willebrand factor)，因此VWF相關(guān)抗原免疫組化可以用來(lái)鑒定HUVECs，該方法簡(jiǎn)單易行。通常采用兔抗人或鼠抗人作為一抗，二抗的來(lái)源廣泛，常用酶標(biāo)二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG)，經(jīng)過(guò)染色后，顯微鏡下觀察攝片，陽(yáng)性反應(yīng)可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒，核周密集。有研究發(fā)現(xiàn)[20]，Ⅷ因子連同VWF共同儲(chǔ)存在weibel- palade body(W-P小體)中,W-P小體等特異性物質(zhì)可以進(jìn)行鑒定，透射電鏡下內(nèi)皮細(xì)胞核膜清晰,胞漿內(nèi)多微絲、微管結(jié)構(gòu),在少數(shù)細(xì)胞核周的胞漿可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞所特有的桿狀小體W-P小體，其為質(zhì)膜包裹,內(nèi)有微管樣結(jié)構(gòu)。但不是所有細(xì)胞都有W-P小體，因此不能作為常規(guī)鑒定的標(biāo)志物。

還有其他化學(xué)染色法可以鑒別內(nèi)皮細(xì)胞，但是不常用于HUVECs的鑒定，分泌一氧化氮是內(nèi)皮細(xì)胞的重要功能，Western blotting檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志酶-一氧化氮合酶的含量也可以用來(lái)鑒定內(nèi)皮細(xì)胞，但是由于這些方法檢測(cè)的是內(nèi)皮細(xì)胞的共性，對(duì)于鑒別HUVECs特異性不高，不能作為常規(guī)檢測(cè)方法。早期有研究采用抗VWF因子抗體免疫熒光標(biāo)記對(duì)HUVECs進(jìn)行鑒定，攝取乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)和吸附Ⅰ型荊豆凝集素(UEA-1)的細(xì)胞功能檢測(cè)也被用做特異性的鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的方法，劉長(zhǎng)樂(lè)等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[21]：Dil-Ac-LDL(熒光標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白)發(fā)紅色熒光，熒光強(qiáng)度高；FITC-UEA-1(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的Ⅰ型荊豆凝集素)發(fā)綠色熒光，熒光強(qiáng)度高；雙熒光陽(yáng)性百分比較高；胞核呈藍(lán)色熒光，有可參考性。

3.3細(xì)胞純度檢測(cè)：鑒定內(nèi)皮細(xì)胞表型常用的抗原標(biāo)記包括CD34、CD144。有研究表明，自從Fina等發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有CD34的基因表達(dá)[22]后,常被用來(lái)標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，CD34表達(dá)強(qiáng)于Ⅷ因子，它被認(rèn)為是目前血管內(nèi)皮細(xì)胞最可靠的標(biāo)記，可進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，但目前較常用的是流式細(xì)胞術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)。CD144為內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志，常用檢測(cè)方法有免疫細(xì)胞化學(xué)法、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)及Western blot檢測(cè)法。張清等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示[23]CD144免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性細(xì)胞，染色表現(xiàn)為細(xì)胞膜附著棕黃色顆粒；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞目的基因CD144有較強(qiáng)表達(dá)；Western blot檢測(cè)傳代的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，顯示高表達(dá)CD144。

近年來(lái)也有人用CD31[24]、sCD54[25]、CD105、 VEGFR[26]來(lái)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。VWF、Ⅰ型荊豆凝集素(UEA-1)結(jié)合率也可用流式細(xì)胞儀來(lái)檢測(cè)，以鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的純度。

3.4細(xì)胞增殖檢測(cè)：MTT法 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力可以反應(yīng)細(xì)胞的活力，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，內(nèi)皮細(xì)胞明顯增殖加快，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[27]，HUVECs接種后1 d細(xì)胞計(jì)數(shù)略有減少，2 d開(kāi)始生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度較慢；3～7 d生長(zhǎng)速度加快,維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；8 d起細(xì)胞發(fā)生接觸抑制，進(jìn)入停滯期，細(xì)胞倍增時(shí)間為72 h。

3.5凍存后復(fù)蘇后管腔形成實(shí)驗(yàn)：凍存后 HUVECs仍然具有成管能力，管腔結(jié)構(gòu)的完整性，管腔大小以及管腔壁厚度與凍存前細(xì)胞所形成的管腔無(wú)明顯差別。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，HUVECs 呈較好的運(yùn)動(dòng)和分化狀態(tài)，培養(yǎng)24 h后在細(xì)胞外基質(zhì)膠 Matrigel 上可見(jiàn)類似于毛細(xì)血管的完整閉合管腔形成[12]，說(shuō)明凍存后細(xì)胞仍能維持內(nèi)皮細(xì)胞的功能，標(biāo)準(zhǔn)凍存后對(duì) HUVECs的功能無(wú)明顯影響。

4 展望

隨著高血壓，冠心病等血管性疾病發(fā)病率增高，與血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的研究成為熱點(diǎn)，目前體外培養(yǎng)的HUVECs是最重要也是最常見(jiàn)的研究心血管疾病的工具細(xì)胞，包括原代HUVECs和HUVECs細(xì)胞株兩種，HUVECs細(xì)胞株種類比較多，多數(shù)是與癌細(xì)胞雜交獲得的，培養(yǎng)要求低，可以無(wú)限傳代。一般用于心血管疾病研究的是ECV304、EA.hy926。相對(duì)于HUVECs細(xì)胞株，原代細(xì)胞培養(yǎng)要求較高，但是由于其材料易于獲得，所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果較符合人體情況，生物學(xué)特性更典型，易于鑒別，有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，研究者可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行選擇。

與動(dòng)物細(xì)胞相比，HUVECs 更接近人體生理狀態(tài)；而與人體動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞相比，HUVECs 取材經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便，且具有與動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特征相似的優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用更加廣泛，為進(jìn)一步研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性以及其與各種疾病的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。本文總結(jié)了臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)的分離、培養(yǎng)、鑒別方法，但是目前仍然存在一些問(wèn)題，目前已經(jīng)經(jīng)過(guò)了多種探究，但是仍然沒(méi)有統(tǒng)一的可實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)，還需要不斷探索，總結(jié)出一套使HUVECs培養(yǎng)效率高、純度好，且簡(jiǎn)單易行，能穩(wěn)定地運(yùn)用于血管相關(guān)疾病研究的細(xì)胞培養(yǎng)方法。

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